Summary

In Vivo Imagerie des souris journaliste Cx3cr1gfp/gfp avec domaine Spectral Optical Coherence Tomography et numérisation Laser ophtalmologique

Published: November 11, 2017
doi:

Summary

Ce protocole décrit comment haute résolution techniques d’imagerie comme la tomographie par cohérence optique de domaine spectral et numérisation laser ophtalmologique peut être utilisé dans les petits rongeurs, à l’aide d’un système de plate-forme d’imagerie ophtalmique, pour obtenir des informations sur épaisseur de la rétine et microgliales cellulaire distribution, respectivement.

Abstract

Tomographie en cohérence optique domaine spectral (SD-OCT) et balayage ophtalmoscopie laser (SLO) sont largement utilisés en ophtalmologie expérimentale. Dans le présent protocole, des souris exprimant le vert protéine fluorescente (gfp) sous le promoteur de Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) ont été utilisés afin d’imager la microglie cellules in vivo dans la rétine. Les microglies sont des macrophages résidant de la rétine et ont été impliqués dans plusieurs maladies de la rétine1,2,3,4,5,6. Ce protocole prévoit une approche détaillée pour la génération de rétiniens B-scans, avec SD-OCT et imagerie de distribution cellulaire microglies chez les souris Cx3cr1gfp/gfp avec SLO in vivo, en utilisant un système de plate-forme d’imagerie ophtalmique. Le protocole peut être utilisé dans plusieurs lignées de souris de journaliste. Cependant, il y a certaines limitations au protocole présenté ici. Tout d’abord, les SLO et SD-OCT, lorsqu’il est utilisé en mode haute résolution, recueillir des données à haute résolution axiale mais la résolution latérale sont plus faible (3,5 µm et 6 µm, respectivement). En outre, le niveau de mise au point et la saturation dans SLO est fortement tributaire de la sélection des paramètres et un alignement correct de l’oeil. En outre, à l’aide de dispositifs conçus pour les patients humains chez la souris est difficile en raison de la puissance optique totale plus élevée de l’oeil de la souris par rapport à le œil humain ; Ceci peut mener au latéral grossissement inexactitudes7, qui dépendent aussi du grossissement de l’objectif de la souris entre autres. Cependant, malgré cette position le balayage axial dépend de grossissement latéral, les mesures de SD-OCT axiales sont exacts8.

Introduction

En ophtalmologie expérimentale, examen de la pathologie rétinienne est généralement évaluée à l’aide de techniques histologiques. Toutefois, histologie exige euthanasie animale et peut provoquer des modifications aux propriétés réelles du tissu. SD-OCT et SLO sont régulièrement utilisées en ophtalmologie clinique pour le diagnostic et pour le suivi de plusieurs maladies de la rétine comme le œdème maculaire diabétique,9,10de la neuropathie optique ischémique antérieure ou rétinite pigmentaire11 . SD-OCT et SLO sont des techniques non invasives qui génèrent des images haute résolution de la rétine, qui sont visualisées à travers la pupille dilatée sans intervention supplémentaire. SD-OCT fournit des informations de structure rétinienne et épaisseur rétinienne en recueillant des données diffusantes pour créer des images en coupe de la rétine, alors que SLO recueille des données de fluorescence pour produire des images stéréoscopiques de contraste élevé de la rétine. De nos jours, les deux techniques sont de plus en plus utilisés en ophtalmologie expérimentale à l’aide de petits rongeurs12,13,14,15 (ou même poisson zèbre16,17) et peut fournir les informations qualitatives et quantitatives12,17,18,19,20,21.

L’accumulation de fluorophores endogènes comme lipofuscins ou la formation de drusen dans la rétine peut être visualisée par SLO comme signal fluorescent auto. Cette caractéristique rend SLO une technique précieuse pour le diagnostic et la surveillance des maladies de la rétine comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge ou la rétinite pigmentaire22,23. En ophtalmologie expérimentale, fluorescence auto imaging (AF) peut être utilisé pour la détection des types spécifiques de cellules dans les lignées de souris journaliste. Par exemple, les souris hétérozygotes pour l’expression de la gfp sous le promoteur de Cx3cr124 sont avantageux pour in vivo visualisation des microglies dans la rétine normale et pour la recherche sur les cellules microgliales/macrophage dynamique dans la maladie de la rétine,21. Les microglies sont les macrophages résidents de la rétine, qui jouent un rôle crucial sur l’homéostasie tissulaire et la réparation des tissus après blessure1,25,26. Activation des microglies dans la rétine a été signalée dans les lésions rétiniennes, ischémie et dégénérescence, suggérant un rôle de ces cellules dans la maladie de la rétine2,3,4,5, 6.

Le but du présent protocole est de décrire une méthode relativement simple pour la mesure d’épaisseur rétinienne à l’aide de SD-OCT et imagerie rétinienne et pour la visualisation des cellules de la microglie positive gfp dans la rétine de souris Cx3cr1gfp/gfp à l’aide SLO (système Spectralis Heidelberg HRA + OCT). Ce protocole peut être utilisé pour les mesures de l’imagerie et l’épaisseur des rétines sains ou malades dans diverses lignées de souris. En outre, les analyses morphométriques peuvent être exécutées pour l’identification et la quantification des microglies numéros et l’activation des microglies dans la rétine à l’aide de SLO21. Les cellules de la microglie sont associées à des maladies dégénératives dans le système nerveux central (CNS), dont la rétine27,28,29. Ainsi, en combinant les deux méthodes utilisées dans le présent protocole, corrélation des microglies distribution et dégénérescence rétinienne peut être faite, ce qui peut faciliter la surveillance gravité de la maladie ou l’efficacité de la thérapeutique des approches in vivo.

Protocol

dans toutes les procédures, les souris BALB/c adultes mâles et femelles qui expriment la gfp sous le promoteur de Cx3cr1 étaient utilisé 24. Souris ont été traitées conformément à la déclaration d’ARVO sur l’utilisation des animaux dans ophtalmique et Vision Research et toutes les procédures ont été approuvées par le gouvernement suisse conformément à la réglementation fédérale suisse sur le bien-être Animal. Souris ont été anesthésiés par une injection sous-…

Representative Results

En utilisant le protocole présenté ici, SD-OCT scanne et SLO images ont été obtenues chez des souris Cx3cr1gfp/gfp dans la même session d’imagerie. Figure 3 comprend représentant SD-OCT simples scans obtenus avec un 30 ° ou 55 ° lentille (Figure 3 a) et images représentatives de SLO obtenues avec un 55 ° ou une lentille de 102 °, où les cellules de la microglie positive gfp sont visualisées. R?…

Discussion

Le présent article montre un protocole pour l’acquisition de B-scans rétiniens et l’imagerie de gfp microglie positive distribution dans la rétine de souris dans la même session d’imagerie. SD-OCT et SLO sont de plus en plus utilisés dans des modèles animaux de la maladie de la rétine à fournir des informations d’altérations rétiniennes fois10,14,17,18,<sup class='x…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par une subvention de la Swiss National Science Foundation (FNS ; #320030_156019). Les auteurs ont bénéficié du soutien non financier Heidelberg Engineering GmBH, Allemagne.

Materials

Spectralis Imaging system (HRA+OCT) Heidelberg Engineering, Germany N/A ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer Heidelberg Engineering, Germany N/A Version 1.9.13.0
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens Volk Optical Inc., Ohio, USA V78C
Spectralis wide angle 55° lens Heidelberg Engineering, Germany 50897-002
ultra widefield 102° lens Heidelberg Engineering, Germany 50117-001
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) Provet AG, Lyssach, Switzerland Swissmedic Nr. 50'590 – ATCvet: QN05CM91 anesthetic/analgesic
ketamine 50mg/ml (Ketalar) Parke-Davis, Zurich, Switzerland 72276388 anesthetic
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) ISPI, Bern, Switzerland N/A pupil dilation
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany 9151125
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) OmniVision, Neuhausen, Switzerland N/A
+4 dpt rigid gas permeable contact lens Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY N/A Base Curve: 7.20 to 8.40 mm
Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm
Power: -25.00 to +25.00 Diopters
balanced salt solution (BSS) Inselspital, Bern, Switzerland N/A
silicon forceps N/A N/A
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) Provet AG, Lyssach, Switzerland N/A α2 adrenergic receptor antagonist
GraphPad Prism 7 GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA N/A statistical analysis software

References

  1. Madeira, M. H., Boia, R., Santos, P. F., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Contribution of microglia-mediated neuroinflammation to retinal degenerative diseases. Mediators Inflamm. , 673090 (2015).
  2. Ng, T. F., Streilein, J. W. Light-induced migration of retinal microglia into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (13), 3301-3310 (2001).
  3. Langmann, T. Microglia activation in retinal degeneration. J Leukoc Biol. 81 (6), 1345-1351 (2007).
  4. Joly, S., et al. Cooperative phagocytes: resident microglia and bone marrow immigrants remove dead photoreceptors in retinal lesions. Am J Pathol. 174 (6), 2310-2323 (2009).
  5. Arroba, A. I., Alvarez-Lindo, N., van Rooijen, N., de la Rosa, E. J. Microglia-mediated IGF-I neuroprotection in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 9124-9130 (2011).
  6. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Exp Eye Res. 81 (6), 700-709 (2005).
  7. Geng, Y., et al. Optical properties of the mouse eye. Biomed Opt Express. 2 (4), 717-738 (2011).
  8. Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in SD-OCT imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
  9. Vaz-Pereira, S., et al. Optical Coherence Tomography Features Of Active And Inactive Retinal Neovascularization In Proliferative Diabetic Retinopathy. Retina. 36 (6), 1132-1142 (2016).
  10. Kokona, D., Haner, N. U., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. Imaging of macrophage dynamics with optical coherence tomography in anterior ischemic optic neuropathy. Exp Eye Res. , (2016).
  11. Makiyama, Y., et al. Macular cone abnormalities in retinitis pigmentosa with preserved central vision using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. PLoS One. 8 (11), e79447 (2013).
  12. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
  13. Joshi, R., et al. Spontaneously occurring fundus findings observed using confocal scanning laser ophthalmoscopy in wild type Sprague Dawley rats. Regul Toxicol Pharmacol. 77, 160-166 (2016).
  14. Muraoka, Y., et al. Real-time imaging of rabbit retina with retinal degeneration by using spectral-domain optical coherence tomography. PLoS One. 7 (4), e36135 (2012).
  15. Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
  16. Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
  17. Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
  18. Huber, G., et al. Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5888-5895 (2009).
  19. Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative Analysis of Mouse Retinal Layers Using Automated Segmentation of Spectral Domain Optical Coherence Tomography Images. Transl Vis Sci Technol. 4 (4), 9 (2015).
  20. Sim, D. A., et al. A simple method for in vivo labelling of infiltrating leukocytes in the mouse retina using indocyanine green dye. Dis Model Mech. 8 (11), 1479-1487 (2015).
  21. Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731 (2015).
  22. Acton, J. H., Cubbidge, R. P., King, H., Galsworthy, P., Gibson, J. M. Drusen detection in retro-mode imaging by a scanning laser ophthalmoscope. Acta Ophthalmol. 89 (5), e404-e411 (2011).
  23. Greenstein, V. C., et al. Structural and functional changes associated with normal and abnormal fundus autofluorescence in patients with retinitis pigmentosa. Retina. 32 (2), 349-357 (2012).
  24. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  25. Wang, X., et al. Requirement for Microglia for the Maintenance of Synaptic Function and Integrity in the Mature Retina. J Neurosci. 36 (9), 2827-2842 (2016).
  26. Ebneter, A., Casson, R. J., Wood, J. P., Chidlow, G. Microglial activation in the visual pathway in experimental glaucoma: spatiotemporal characterization and correlation with axonal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6448-6460 (2010).
  27. Ebneter, A., Kokona, D., Schneider, N., Zinkernagel, M. S. Microglia Activation and Recruitment of Circulating Macrophages During Ischemic Experimental Branch Retinal Vein Occlusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 944-953 (2017).
  28. Lin, Y. L., Potter-Baker, K. A. Using theoretical models from adult stroke recovery to improve use of non-invasive brain stimulation for children with congenital hemiparesis. J Neurophysiol. , (2017).
  29. Combadiere, C., et al. CX3CR1-dependent subretinal microglia cell accumulation is associated with cardinal features of age-related macular degeneration. J Clin Invest. 117 (10), 2920-2928 (2007).
  30. Bermudez, M. A., et al. Time course of cold cataract development in anesthetized mice. Curr Eye Res. 36 (3), 278-284 (2011).
  31. Toth, C. A., et al. A comparison of retinal morphology viewed by optical coherence tomography and by light microscopy. Arch Ophthalmol. 115 (11), 1425-1428 (1997).
  32. Ebneter, A., Kokona, D., Jovanovic, J., Zinkernagel, M. S. Dramatic Effect of Oral CSF-1R Kinase Inhibitor on Retinal Microglia Revealed by In Vivo Scanning Laser Ophthalmoscopy. Transl Vis Sci Technol. 6 (2), 10 (2017).
  33. Gabriele, M. L., et al. Reproducibility of spectral-domain optical coherence tomography total retinal thickness measurements in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6519-6523 (2010).
  34. Nakao, S., et al. Wide-field laser ophthalmoscopy for mice: a novel evaluation system for retinal/choroidal angiogenesis in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5288-5293 (2013).
  35. Wang, N. K., et al. Origin of fundus hyperautofluorescent spots and their role in retinal degeneration in a mouse model of Goldmann-Favre syndrome. Dis Model Mech. 6 (5), 1113-1122 (2013).
  36. Wang, N. K., et al. Cellular origin of fundus autofluorescence in patients and mice with a defective NR2E3 gene. Br J Ophthalmol. 93 (9), 1234-1240 (2009).
  37. Thanos, S. Sick photoreceptors attract activated microglia from the ganglion cell layer: a model to study the inflammatory cascades in rats with inherited retinal dystrophy. Brain Res. 588 (1), 21-28 (1992).
  38. Hughes, E. H., et al. Generation of activated sialoadhesin-positive microglia during retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (5), 2229-2234 (2003).
check_url/cn/55984?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy. J. Vis. Exp. (129), e55984, doi:10.3791/55984 (2017).

View Video