In Vivo Imaging dei topi Reporter Cx3cr1gfp/gfp con tomografia a coerenza ottica Spectral-domain e scansione Laser oftalmoscopia
Summary
Questo protocollo descrive come ad alta definizione tecniche di imaging come la tomografia ottica di coerenza di dominio spettrale e scansione laser oftalmoscopia può essere utilizzata in piccoli roditori, utilizzando un sistema di piattaforma di imaging oftalmico, per ottenere informazioni su lo spessore retinico e microglial cellula distribuzione, rispettivamente.
Abstract
Tomografia a coerenza ottica dominio spettrale (SD-OCT) e oftalmoscopia di scansione laser (SLO) sono ampiamente utilizzati in Oftalmologia sperimentale. Nel presente protocollo, topi che esprimono verde proteina fluorescente (gfp) sotto il promotore di Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) sono stati utilizzati per immagine microglia cellule in vivo nella retina. Le microglia sono macrofagi residenti della retina e sono stati implicati in diverse patologie retiniche1,2,3,4,5,6. Questo protocollo fornisce un approccio dettagliato per la generazione di retinica B-Scan, con SD-OCT e la formazione immagine di distribuzione delle cellule di microglia in topi Cx3cr1gfp/gfp con SLO in vivo, utilizzando un sistema di piattaforma di imaging oftalmico. Il protocollo può essere utilizzato in diverse linee di reporter del mouse. Tuttavia, esistono alcune limitazioni del protocollo presentato qui. In primo luogo, sia SLO e SD-OCT, quando usato in modalità ad alta risoluzione, raccogliere dati con alta risoluzione assiale ma la risoluzione laterale sono più bassi (3,5 µm e 6 µm, rispettivamente). Inoltre, il livello di messa a fuoco e saturazione in SLO è fortemente dipendente dalla selezione dei parametri ed il corretto allineamento dell’occhio. Inoltre, utilizzando dispositivi progettati per pazienti umani in topi è impegnativo a causa della maggiore potenza totale ottica dell’occhio del mouse rispetto all’occhio umano; Questo può portare a laterale ingrandimento imprecisioni7, che dipendono anche l’ingrandimento con la lente del mouse tra gli altri. Tuttavia, nonostante che la scansione assiale posizione dipende dall’ingrandimento laterale, le misurazioni di SD-OCT assiale sono accurati8.
Introduction
In Oftalmologia sperimentale, l’esame di patologia retinica viene solitamente valutato utilizzando tecniche istologiche. Tuttavia, l’istologia richiede euthanization animale e può causare alterazione per le proprietà effettive del tessuto. SD-OCT e SLO sono abitualmente utilizzati in Oftalmologia clinica a fini diagnostici e per il monitoraggio delle diverse patologie retiniche quali l’edema maculare diabetico9, neuropatia ottica ischemica anteriore10o retinite pigmentosa11 . SD-OCT e SLO sono tecniche non invasive che generano immagini ad alta risoluzione della retina, che sono visualizzati attraverso la pupilla dilatata senza ulteriori interventi. SD-OCT fornisce informazioni della struttura retinica e lo spessore retinico raccogliendo dati di retrodiffusione per creare immagini a sezione trasversale della retina, mentre SLO raccoglie i dati di fluorescenza per produrre immagini stereoscopiche ad alto contrasto della retina. Al giorno d’oggi, entrambe le tecniche sono sempre più utilizzate in Oftalmologia sperimentale utilizzando piccoli roditori12,13,14,15 (o anche zebrafish16,17) e può fornire sia informazioni qualitative e quantitative12,17,18,19,20,21.
Accumulo di fluorofori endogeni come lipofuscine o la formazione di drusen nella retina possa essere visualizzata da SLO come segnale fluorescente automatico. Questa caratteristica rende SLO una tecnica importante per la diagnosi e il monitoraggio delle patologie retiniche come la degenerazione maculare senile o retinite pigmentosa22,23. In Oftalmologia sperimentale, fluorescenza auto imaging (AF) può essere utilizzato per il rilevamento di tipi cellulari specifici nelle linee di reporter del mouse. Ad esempio, topi eterozigoti per l’espressione della gfp sotto il promotore di Cx3cr124 sono vantaggiosi per la visualizzazione in vivo di cellule microgliali nella retina normale e per l’indagine di microglia/macrofagi dinamica nella malattia retinica21. Le microglia sono i macrofagi residenti della retina, che svolgono un ruolo cruciale su omeostasi tissutale e riparazione tissutale su lesioni1,25,26. Attivazione della microglia nella retina è stata segnalata in lesione retinica, l’ischemia e la degenerazione, suggerendo un ruolo di queste cellule nella malattia retinica2,3,4,5, 6.
L’obiettivo del presente protocollo è di descrivere un metodo relativamente semplice per l’imaging retinico e misurazione dello spessore retinico con SD-OCT e per la visualizzazione delle cellule di microglia positivo di gfp nel mouse retina utilizzando Cx3cr1gfp/gfp SLO (sistema di Heidelberg Spectralis HRA + OCT). Questo protocollo può essere utilizzato per misure di imaging e spessore delle retine sane o malate in varie linee del mouse. Inoltre, le analisi morfometriche possono essere eseguite per l’identificazione e la quantificazione dei numeri di microglia e attivazione di microglia nella retina utilizzando SLO21. Cellule di microglia sono associate con malattie degeneranti nel sistema nervoso centrale (CNS), compreso la retina27,28,29. Così, combinando i due metodi utilizzati nel presente protocollo, correlazione della distribuzione di microglia e degenerazione retinica può essere fatto, che può facilitare il monitoraggio la gravità della malattia o l’efficacia di terapeutica si avvicina in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente articolo viene illustrato un protocollo per l’acquisizione di B-scansioni della retina e l’imaging di gfp positivo microglia distribuzione nella retina di topo nella stessa sessione di imaging. SD-OCT e SLO sono sempre più utilizzati nei modelli animali della malattia retinica per fornire informazioni di alterazioni retiniche sopra tempo10,14,17,18,21</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da un grant della Swiss National Science Foundation (FNS; #320030_156019). Gli autori hanno ricevevano assistenza non finanziaria da Heidelberg Engineering GmBH, Germania.
Materials
| Spectralis Imaging system (HRA+OCT) | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.13.0 |
| 78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens | Volk Optical Inc., Ohio, USA | V78C | |
| Spectralis wide angle 55° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50897-002 | |
| ultra widefield 102° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50117-001 | |
| medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | Swissmedic Nr. 50'590 – ATCvet: QN05CM91 | anesthetic/analgesic |
| ketamine 50mg/ml (Ketalar) | Parke-Davis, Zurich, Switzerland | 72276388 | anesthetic |
| tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) | ISPI, Bern, Switzerland | N/A | pupil dilation |
| Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm | B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany | 9151125 | |
| hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | N/A | |
| +4 dpt rigid gas permeable contact lens | Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY | N/A | Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters |
| balanced salt solution (BSS) | Inselspital, Bern, Switzerland | N/A | |
| silicon forceps | N/A | N/A | |
| atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | N/A | α2 adrenergic receptor antagonist |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software |
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