Der murinen Cholin-Mangel, Ethionine ergänzt (CDE) Diät-Modell einer chronischen Leberschädigung
Summary
Hier beschreiben wir eine gängige Methode um chronische Schädigung der Leber bei Mäusen zu induzieren, durch die Fütterung einer Cholin-Mangel und Ethionine ergänzt (CDE) Ernährung. Wir zeigen Systemüberwachung, Leber Perfusion, Isolation und Erhaltung. Schädigung der Leber, Pathohistology, Fibrose, entzündliche, und Leber Stammvater-Zell-Reaktionen kann ein zeitlichen Verlauf von sechs Wochen mitteilen.
Abstract
Chronische Erkrankungen der Leber, z. B. Virushepatitis, alkoholische Leberkrankheit oder nicht-alkoholische Fettleber, zeichnen sich durch kontinuierliche Entzündung, fortschreitende Zerstörung und Regeneration der Leber Parenchym, Leber Stammvater Zelle Proliferation und Fibrose. Das Endstadium einer jeden chronische Lebererkrankung ist Leberzirrhose, ein wichtiger Risikofaktor für die Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms. Um Prozesse, die Regulierung der Krankheit Einleitung, Aufbau und Verlauf zu untersuchen, werden verschiedenen Tiermodellen in Laboratorien verwendet. Hier beschreiben wir einen sechswöchige zeitlicher Verlauf des Cholin-Mangel und Ethionine ergänzt (CDE) Mausmodells, umfasst sechs – Wochen alten männlichen C57BL/6J Mäuse mit Cholin-defizienten Chow und 0,15 % DL-Ethionine-ergänzt Trinkwasser zu füttern. Überwachung der Tiergesundheit und eine typische Körperkurve Gewicht Verlust werden erläutert. Das Protokoll zeigt die grobe Prüfung einer CDE-behandelte Leber und Blut-Sammlung durch Herzpunktion für nachfolgende Serum Analysen. Als nächstes sind die Leber Perfusion Technik und Sammlung von verschiedenen Leber-Lappen für Standardauswertungen gezeigt, einschließlich Leber Histologie Einschätzungen von Hämatoxylin und Eosin oder Sirius Rote Färbungen, immunofluorescent Erkennung von hepatischen Zellpopulationen sowie Transkriptom profiling der Leber Mikroumgebung. Dieses Maus-Modell eignet sich für entzündliche studieren, Fibrogenic und Leber Stammvater Zelle Dynamik induziert durch chronische Lebererkrankungen und kann verwendet werden, um potenzielle Therapeutika zu testen, die diese Prozesse modulieren kann.
Introduction
Die Leber ist die größte glanduläre Stoffwechselorgan des Körpers und hat viele komplexe Funktionen. Schlüsselrollen für die Leber gehören Verdauung, Stoffwechsel, Entgiftung, Speicherung von Nährstoffen, Herstellung von Blutplasma Proteinkomponenten und durch ansässige Makrophagen oder Kupffer Zellen vermittelte Immunität. Die Leber hat eine große Fähigkeit zu regenerieren, auch wenn bis zu 70-90 % seiner gesamten Masse verloren geht. Im Falle einer akuten Schädigung der Leber vermehren sich die verbleibenden gesunden Hepatozyten wie gesehen nach einer teilweisen Hepatektomie oder Paracetamol-Vergiftung, um den Schaden in einer hochgradig koordinierten Prozess1reparieren. Wenn die Hepatozyten durch langfristige virale Infektion, alkoholische und nicht-alkoholische Fettleber, chronisch verletzt sind die entzündlichen Mikroumgebung löst jedoch die Aktivierung des Ganglion Leberzellen Fibrose fahren und die Verbreitung von Leber Vorläuferzellen (LPCs) mit dem Potential, in Cholangiocytes oder Hepatozyten2,3,4,5zu unterscheiden. Die genaue Herkunft Differenzierung Schicksal der LPCs, ihren Beitrag zur Leberregeneration und Hepatocarcinogenesis Themen intensiv diskutiert wurden und wahrscheinlich hängen von der Schwere der Verletzung und Kontext2. Die Reihenfolge der frühen Regeneration verbundenen Ereignisse wird auch kontrovers diskutiert, mit einigen Ermittler, die besagt, dass hepatische stellate Zelle Aktivierung und Umbau-Matrix ist wesentlich für die Erzeugung eines LPC-Begünstigung Nische6, während andere, Bericht, dass LPC Expansion und die so genannte Ductular Reaktion auf Trigger Fibrogenese7erforderlich sind. Es gibt zahlreiche Tiermodelle, spezifische Aspekte der Schädigung und Regeneration, in einem Versuch, die zugrunde liegenden Faktoren zu verstehen, die Fortschreiten der Erkrankung zu regulieren und letztendlich neue Behandlungsstrategien bei Patienten8entwickeln zu studieren.
Die Cholin-Mangel und Ethionine ergänzt (CDE) diätetische Modell wurde ursprünglich entwickelt für den Einsatz in Ratten und später für die chronische Schädigung der Leber Induktion in Mäusen9,10modifiziert. Diätetischen Mangel an Cholin führt zu eingeschränkter Montage und Sekretion von sehr Low-Density-Lipoproteine. In Kombination mit der Hepatocarcinogen DL-Ethionine, diese Therapie führt zu übermäßiger hepatische Fett Laden, kontinuierliche Entzündung, Fibrose Periportal, LPC Reaktion und langfristig an hepatozellulären Karzinom Entwicklung11,12 . Wichtig ist, allerdings zeigen verschiedene Mausstämme markante Mustern von entzündlichen, Fibrogenic und LPC Antwort Dynamik13. Dieses Protokoll beschreibt chronische Schädigung der Leber Induktion in den Mäusen C57BL/6J, die am häufigsten verwendeten Inzucht Maus Belastung.
Chronische Lebererkrankung Forschung umfassen typische Analysen histologische Bewertung von Hämatoxylin und Eosin sowie Sirius rote Färbung, um Kollagen Ablagerungen, immunhistochemische oder immunofluorescent Erkennung von hepatischen Zellpopulationen zu visualisieren, und transkriptomischen Analysen von der Leber Mikroumgebung, die induzierte Zellveränderungen durch komplexe Wachstumsfaktoren und Cytokine orchestriert Netzwerke14,15,16,17 , 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chronischer Lebererkrankung ist oft eine stille Krankheit bei den meisten Patienten asymptomatisch sein und es ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit. Chronischer Alkoholismus und Hepatitis C-Virus-Infektion sind die häufigsten Todesursachen. Chronische Schädigung der Leber zeichnet sich durch hepatischen Entzündung, Fibrose und in schweren Fällen Zirrhose, Karzinom und letztlich Leberversagen. Es gibt derzeit keine Heilung, und zwar große Fortschritte erzielt wurden, die Mechanismen vo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Health and Medical Research Council (NHMRC) von Australien (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Die Autoren möchten die Curtin Health Innovation Research Institute Mitarbeiter für technische Hilfe bedanken.
Materials
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 | |
References
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 836-847 (2004).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G143-G154 (2016).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17, 971-983 (2015).
- Prakoso, E., et al. Analysis of the intrahepatic ductular reaction and progenitor cell responses in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation. Liver Transpl. 20, 1508-1519 (2014).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39, 2226-2239 (2007).
- Van Hul, N. K., Abarca-Quinones, J., Sempoux, C., Horsmans, Y., Leclercq, I. A. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 1625-1635 (2009).
- Clouston, A. D., et al. Fibrosis correlates with a ductular reaction in hepatitis C: roles of impaired replication, progenitor cells and steatosis. Hepatology. 41, 809-818 (2005).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration – mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 473-485 (2016).
- Akhurst, B., et al. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology. 34, 519-522 (2001).
- Shinozuka, H., Lombardi, B., Sell, S., Iammarino, R. M. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet. Cancer Res. 38, 1092-1098 (1978).
- Knight, B., Tirnitz-Parker, J. E., Olynyk, J. K. C-kit inhibition by imatinib mesylate attenuates progenitor cell expansion and inhibits liver tumor formation in mice. Gastroenterology. 135, 969-979 (2008).
- Kohn-Gaone, J., et al. Divergent Inflammatory, Fibrogenic, and Liver Progenitor Cell Dynamics in Two Common Mouse Models of Chronic Liver Injury. Am J Pathol. 186, 1762-1774 (2016).
- Knight, B., et al. Attenuated liver progenitor (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/c inbred strain of mice. J Hepatol. 46, 134-141 (2007).
- Dwyer, B. J., Olynyk, J. K., Ramm, G. A., Tirnitz-Parker, J. E. TWEAK and LTbeta Signaling during Chronic Liver Disease. Front Immunol. 5, 39 (2014).
- Karin, M., Clevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature. 529, 307-315 (2016).
- Ruddell, R. G., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling regulates hepatic stellate cell function and wound healing in a murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 227-239 (2009).
- Tirnitz-Parker, J. E., et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells. Hepatology. 52, 291-302 (2010).
- Viebahn, C. S., Yeoh, G. C. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. Int J Biochem Cell Biol. 40, 855-873 (2008).
- Hayner, N. T., Braun, L., Yaswen, P., Brooks, M., Fausto, N. Isozyme profiles of oval cells, parenchymal cells, and biliary cells isolated by centrifugal elutriation from normal and preneoplastic livers. Cancer Res. 44, 332-338 (1984).
- Tee, L. B., Smith, P. G., Yeoh, G. C. Expression of alpha, mu and pi class glutathione S-transferases in oval and ductal cells in liver of rats placed on a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Carcinogenesis. 13, 1879-1885 (1992).
- Chayanupatkul, M., et al. Hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol. 66, 355-362 (2017).
- Mittal, S., et al. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 14, 124-131 (2016).
