El murino colina deficientes, suplementada con Ethionine (CDE) dieta de modelo de la lesión hepática crónica
Summary
Aquí describimos un método común para inducir lesión hepática crónica en ratones por la alimentación de una dieta de deficiencia de colina y suplementada con ethionine (CDE). Demostramos la vigilancia de la salud, la perfusión hepática, aislamiento y conservación. Un curso de tiempo de seis semanas puede informar sobre la lesión del higado, pathohistology, fibrosis, inflamación y las respuestas de células progenitoras hepáticas.
Abstract
Enfermedades crónicas del hígado, como hepatitis viral, enfermedad del higado alcohólica o enfermedad del hígado graso no alcohólico, se caracterizan por la inflamación continua, progresiva destrucción y regeneración de la célula progenitora de parénquima hepático, hígado proliferación y fibrosis. La fase final de cada enfermedad crónica del hígado es la cirrosis, principal factor de riesgo para el desarrollo de carcinoma hepatocelular. Para estudiar procesos de regulación de la progresión, el establecimiento y la iniciación de la enfermedad, varios modelos animales se utilizan en laboratorios. Aquí describimos un curso de seis semanas de tiempo del deficiencia de colina y suplementada con ethionine (CDE) ratón modelo, que implica la alimentación de seis semanas de edad ratones C57BL/6J machos deficientes en colina chow y 0.15% DL-ethionine-suplido de agua potable. Vigilancia de la salud animal y una curva de pérdida de peso de cuerpo típicas son explicados. El protocolo demuestra el examen macroscópico de una colección de hígado y la sangre CDE tratados por punción cardiaca para análisis posterior del suero. A continuación, la técnica de perfusión hepática y colección de diferentes lóbulos hepáticos para evaluaciones estándar son evaluaciones de la histología hepática muestra, incluyendo por hematoxilina y eosina o Sirius rojo stainings, detección inmunofluorescente de poblaciones de la célula hepática así como perfiles de transcriptoma del microambiente hepático. Este modelo de ratón es conveniente para estudiar inflamatoria fibrogénicos y células progenitoras hepáticas dinámica inducida por la enfermedad hepática crónica y puede ser utilizado para probar a posibles agentes terapéuticos que pueden modular estos procesos.
Introduction
El hígado es el órgano metabólico glandular más grande del cuerpo y tiene muchas funciones complejas. Funciones clave para el hígado incluyen desintoxicación, digestión, metabolismo, almacenamiento de nutrientes esenciales, producción de componentes de proteína del plasma de la sangre y la inmunidad mediada por células de Kupffer o macrófagos residentes. El hígado tiene una gran capacidad para regenerar incluso si se pierde hasta el 70-90% de su masa total. En caso de lesión del higado aguda, tal como se ve después de una hepatectomía parcial o acetaminophen envenenamiento, proliferan los hepatocitos sanos restantes para reparar el daño en un proceso altamente coordinado1. Sin embargo, cuando los hepatocitos se lesionan crónico debido a la infección viral a largo plazo, alcohólica o no alcohólica hígado graso, el microambiente inflamatorio desencadena la activación de células radiadas hepáticas fibrosis de conducción y la proliferación de las células progenitoras hepáticas (LPCs) con el potencial de diferenciarse en cholangiocytes o hepatocitos2,3,4,5. El origen exacto, suerte de diferenciación de LPCs, su contribución a la regeneración hepática y hepatocarcinogenesis han sido temas de intenso debate y probablemente dependen de la severidad de la lesión y contexto2. El orden de los acontecimientos tempranos asociados de regeneración se discute también polémico, con algunos investigadores indicando que la activación de las células radiadas hepáticas y la remodelación de la matriz es esencial para la generación de un LPC favoreciendo nicho6, mientras que otros Informe que expansión de LPC y la llamada reacción Ductular deben gatillo fibrogenesis7. Hay numerosos modelos animales para el estudio de aspectos específicos de la lesión y la regeneración, en un intento de comprender los factores subyacentes que regulan la progresión de la enfermedad y en última instancia, desarrollar nuevas estrategias de tratamiento para pacientes8.
El modelo dietético de deficiencia de colina y suplementada con ethionine (CDE) fue originalmente desarrollado para su uso en ratas y más tarde modificado para la inducción de lesión hepática crónica en ratones9,10. La deficiencia dietética de colina resultado deteriorada ensamblaje y secreción de lipoproteínas de baja densidad muy. Combinado con el hepatocarcinógeno DL-ethionine, este régimen conduce a exceso de grasa hepático carga, inflamación continua, fibrosis periportal, respuesta LPC y a largo plazo a hepatocelular carcinoma desarrollo11,12 . Sin embargo, lo importante es que, las cepas de ratón diferente exhiben patrones distintivos de inflamatoria, fibrogénicos y LPC respuesta dinámica13. Este protocolo describe la cepa de ratón de inducción en ratones C57BL/6J, los más utilizados endogámica de lesión hepática crónica.
En la investigación de la enfermedad hepática crónica, análisis típicos incluyen evaluaciones histológicas por hematoxilina y eosina como Sirius rojo tinción para visualizar depósitos de colágeno, inmunohistoquímica o detección inmunofluorescente de poblaciones de la célula hepática, Análisis transcriptómico del microambiente hepático que coordina los cambios celulares inducidos por complejo factor de crecimiento y citocinas redes14,15,16,17 y , 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enfermedad del higado crónica a menudo es una enfermedad silenciosa con la mayoría de los pacientes están asintomáticos y es uno de los principales contribuyentes a la morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Alcoholismo crónico y la infección del virus de la hepatitis C son las principales causas. Lesión hepática crónica se caracteriza por la inflamación hepática, fibrosis y en casos graves cirrosis, carcinoma y falta de hígado en última instancia. Actualmente no existe cura disponible y aunque se han logr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la salud nacional y el Consejo de investigación médica (NHMRC) de Australia (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Los autores quieren agradecer al personal del Instituto de investigación de innovación de Curtin salud para asistencia técnica.
Materials
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 | |
References
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