Eine Array-basierte Comparative genomische Hybridisierung Plattform für effiziente Erkennung der Kopie Zahl Variationen in schnellen Neutronen induziert Medicago Truncatula Mutanten
Summary
Dieses Protokoll bietet experimentelle Schritte und Informationen über Reagenzien, Ausrüstung und Analyse-Tools für Forscher, die gesamte Genom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) Analyse der Kopie Zahl Variationen in interessieren Pflanzen.
Abstract
Mutanten sind wertvolle genetische Ressourcen für Funktionsstudien gen. Um mutierte Sammlungen zu generieren, können drei Arten von mutagenen genutzt werden, einschließlich biologischer wie T-DNA oder Transposon, chemische wie Ethyl Methanesulfonate (EMS) oder physische wie Ionisation Strahlung. Die Art der Mutation beobachtet variiert je nach der Mutagen verwendet. Ionisation Strahlung induzierten Mutanten sind Mutationen löschen, duplizieren oder Neuordnung. Während T-DNA oder Transposon-basierte Mutagenese, auf Arten, die zur Transformation unterliegen beschränkt, kann chemische oder physikalische Mutagenese auf verschiedenste Arten angewendet werden. Allerdings stützt sich die Charakterisierung der Mutationen abgeleitet von chemischen oder physikalischen Mutagenese traditionell auf eine kartenbasierte Klonen Ansatz, ist arbeitsintensiv und zeitaufwendig. Hier zeigen wir, dass eine High-Density-Genom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (aCGH) Plattform angewendet werden kann, um effizient zu erkennen und zu charakterisieren, Kopie Nummer Variationen (CNV) in Mutanten abgeleitet von schnellen Neutronen Bombardement (FNB) Mutagenese in Medicago Truncatula, ein Leguminosenarten. Gesamte Genom-Sequenzanalyse zeigt, dass es mehr als 50.000 Gene oder gen Modelle in M. Truncatula. Im vorliegenden, FNB-induzierten Mutanten in M. Truncatula stammen aus mehr als 150.000 Linien, M1, die wertvolle genetische Ressourcen für funktionelle Studien der Gene im Genom darstellen. Die hier beschriebenen aCGH-Plattform ist ein effizientes Werkzeug zur Charakterisierung von FNB-induzierten Mutanten in M. Truncatula.
Introduction
Hülsenfrüchte (Fabaceae) sind die drittgrößte Familie der Blütenpflanzen, mit vielen wirtschaftlich wichtige Arten wie Soja (Glycine Max) und Alfalfa (Medicago Sativa). Hülsenfrucht Pflanzen können interagieren mit Stickstoff-fixierenden Bodenbakterien, im allgemeinen genannt Rhizobien Wurzelknöllchen zu entwickeln, in denen die atmosphärische Distickstoff auf Ammoniak für den Einsatz von der Wirtspflanze reduziert wird. Als solche Anbau von Leguminosen Pflanzen erfordert wenig Input von Stickstoffdüngemitteln und trägt somit zu einer nachhaltigen Landwirtschaft. Hülsenfrucht Getreide produzieren Blätter und Samen mit hohem Proteingehalt, dient als ausgezeichnete Futter und Getreide. Kultivierte Leguminosenarten haben jedoch in der Regel komplexe Genom Strukturen, wodurch funktionelle Studien von Genen, die Schlüsselrollen in Leguminosen-spezifische Prozesse umständlich zu spielen. Medicago Truncatula wurde weit als eine Art Modell für Hülsenfrucht Studien angenommen worden, vor allem, weil (1) es hat eine diploide Genom mit einer relativ kleinen haploiden Genomgröße (~ 550 Mbp); (2) Pflanzen können stabil für funktionelle Studien gen umgewandelt werden; und (3) Es ist eng verwandt mit Luzerne (M. Sativa), die Königin der Futterpflanzen und viele andere wirtschaftlich bedeutenden Kulturen für Translationale Studien. Vor kurzem, die Genomsequenz des M. Truncatula cv Jemalong A17 wurde freigegeben1,2. Anmerkung des Genoms zeigt, dass mehr als 50.000 vorhergesagten Genen oder gen-Modelle im Genom vorhanden sind. Um festzustellen, die Funktion der meisten Gene in die M. Truncatula ist Genom eine anspruchsvolle Aufgabe. Um funktionelle Studien von Genen zu erleichtern, eine umfassende Sammlung von Mutanten in den Bereich von mehr als 150.000 M1 Zeilen generiert wurde mit schnellen Neutronen Bombardement (FNB) Mutagenese in M. Truncatula cv Jemalong A173 ,4. Schnellen Neutronen, einer hochenergetischen Ionisation Mutagen, worden ist bei der Schaffung von Mutanten in vielen Pflanzenarten, darunter Arabidopsis5,6, Reis (Oryza Sativa)7, Tomate (Solanum verwendet Lycopersicum), Sojaöl (Glycine Soja; G. max)8,9, Gerste (Hordeum Vulgare) und Lotus Japonicus10. Ein Großteil der Mutationen von FNB Mutagenese abgeleitet sind aufgrund von DNA-Löschungen, liegen in der Größenordnung von ein paar Basenpaare an Mega Basenpaare9,11. Viele Phänotyp-Assoziierte Gene wurden erfolgreich identifiziert und charakterisiert,4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. zuvor molekularen Klonen der zugrunde liegenden Gene von FNB Mutanten stützte sich auf eine Karte-basierte Ansatz, der ist zeitaufwendig und begrenzt die Anzahl der Mutanten auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Vor kurzem mehrere kostenlose Ansätze einschließlich Protokoll-basierte Methoden, Genom Fliesen Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) für DNA-Kopie Nummer Variation Erkennung und kompletten Genoms eingesetzt zur Erleichterung der Charakterisierung der Löschung Mutanten in verschiedenen Organismen, einschließlich der Tiere und Pflanzen20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.
Um die Charakterisierung der FNB Mutanten in M. Truncatula, ein Vollständiggenom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) zu erleichtern hat die Plattform entwickelt und validiert. Wie berichtet in tierischen Systeme kann die Array-CGH Plattform Kopie Nummer Variationen (CNV) auf der Ebene der gesamten Genoms in M. Truncatula FNB Mutanten. Darüber hinaus Läsionen können mittels PCR bestätigt werden und Löschung Grenzen durch Sequenzierung identifiziert werden können. Insgesamt ist der Array-CGH-Plattform ein effizientes und effektives Werkzeug bei der Identifizierung von Läsionen in M. Truncatula FNB Mutanten. Hier werden die Array-CGH-Verfahren und PCR Charakterisierung der Löschung Grenzen in einem M. Truncatula FNB Mutant illustriert.
Das folgende Protokoll bietet experimentelle Schritte und Informationen über Reagenzien, Ausrüstung und Analyse-Tools für Forscher, die gesamte Genom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) Analyse der Kopienzahl interessieren Variationen in Pflanzen. Als Beispiel diente Medicago Truncatula FN6191 Mutant Löschung Regionen und Kandidatengene zugeordnete mutierten Phänotypen zu identifizieren. M. Truncatula FN6191 Mutant, ursprünglich von einem schnellen Neutronen Bombardierung verursachten Löschung mutierten Sammlung32 isoliert (siehe Tabelle der Materialien), stellte einen hyper-Nodulation Phänotyp nach Inokulation mit dem Boden Bakterium, Sihorhizobium Meliloti Sm1021, im Gegensatz zu Wildtyp-Pflanzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Haben wir eine Array-CGH Plattform für die Erkennung und Charakterisierung von schnellen Neutronen Bombardement (FNB)-induzierten Mutanten in M. Truncatula CV Jemalong A17. Um die Verwendung von Array CGH Methode bei der Aufdeckung von Gen-Mutationen zu demonstrieren, führten wir aCGH Analyse des mutierten FN6191, die einen hyper-Nodulation Phänotyp im Gegensatz zu Wildtyp-Pflanzen ausgestellt, wenn mit S. Meliloti Sm1021geimpft. Für die Segmentierung Analyse galt ein Segment erhebliche wenn das Log…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird teilweise durch einen Zuschuss von NSF Pflanzengenomforschung (IOS-1127155) finanziert.
Materials
| Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M | Agilent | G4123A | |
| Medicago truncatula FN6191 (mutant) | In house | FN6191 | |
| Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) | In house | A17 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | 1000D | |
| SureTag DNA Labeling Kit | Agilent | 5190-3400 | |
| Random primer | Agilent | 5190-3399 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
| Thermocycler | MJ research | PTC-200 | |
| Centrifuge | Labnet international Inc | Spectrafuge 24D | |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | 5185-5979 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | 5188-5380 | |
| Hybridization Chamber gasket slides | Agilent | G2505 | |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | 5190-3393 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 | Agilent | 5188-5221 | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | G2534A | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | |
| Purification Columns | Agilent | 5190-3391 | |
| Laser scanner | Roche | MS200 | |
| NimbleScan 2.6 | Roche Nimblegen | 5225035001 | |
| Signal Map 1.9 | Roche Nimblegen | Signalmap1.9 |
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