Dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon için bir Platform verimli algılama varyasyonları kopya numarası hızlı nötron kaynaklı Medicago truncatula mutantlar içinde
Summary
Bu iletişim kuralı kopya numarası değişimler tüm genom dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) analizi yürütmektedir ilgilenen araştırmacılar için deneysel adımlar ve reaktifler, ekipman ve çözümleme araçları hakkında bilgi sağlar bitkiler.
Abstract
Mutant gen işlevi çalışmalar için çok değerli genetik kaynaklardır. Mutant koleksiyonları oluşturmak için üç tür mutajen, dahil olmak üzere biyolojik T-DNA veya transposon gibi etil methanesulfonate (EMS) gibi kimyasal ya da fiziksel iyonlaşma radyasyonu gibi yararlı olabilir. Gözlenen mutasyon türü kullanılan alkil bağlı olarak değişir. İyonlaşma radyasyonu indüklenen mutantlar için silme, kopyalama veya yeniden mutasyonlar içerir. T-DNA veya mutagenesis transposon tabanlı dönüştürme için duyarlı türler için sınırlı olmakla birlikte, kimyasal veya fiziksel mutagenesis çok çeşitli türler için uygulanabilir. Ancak, geleneksel olarak kimyasal ve fiziksel mutagenesis türetilmiş mutasyonlar karakterizasyonu emek yoğun ve zaman alıcı olan bir harita tabanlı klonlama yaklaşım, dayanır. İşte, bir yüksek yoğunluklu genom Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (aCGH) dizi tabanlı platform etkili bir şekilde algılamak ve kopya numarası değişimler (CNVs) hızlı nötron bombardımanı (FNB) mutagenesis türetilen mutantlar karakterize uygulanabilir olduğunu göstermektedir Medicago truncatula, baklagil türler. Tüm genom dizi analizi orada 50.000’den fazla gen veya gen modellerin M. truncatulagöstermektedir. M. truncatula mevcut, FNB kaynaklı mutantlar, genom genlerin fonksiyonel çalışmalar için çok değerli genetik kaynakları temsil eden 150.000’den fazla M1 satırları türetilir. Burada açıklanan aCGH platformu FNB kaynaklı mutantlar M. truncatulaolarak karakterize için etkili bir araçtır.
Introduction
Baklagiller (baklagiller) soya (Glycine max) ve yonca (Medicago sativa) gibi pek çok ekonomik açıdan önemli türler ile çiçekli bitkilerin üçüncü büyük aile vardır. Baklagil bitkileri genellikle hangi atmosferik diazot amonyak kullanmak için ana bitki tarafından azalır kök nodüller geliştirmeye Rhizobia adlandırılan toprak bakteriler, azot sabitleme ile etkileşim kurabilir. Bu nedenle, baklagil bitkileri ekimi azot gübreler küçük giriş gerektirir ve böylece sürdürülebilir tarım için katkıda bulunur. Baklagil bitkileri yaprak ve tohum mükemmel yem ve tahıl ürünleri hizmet veren yüksek protein içerikli üretmek. Ancak, ekili baklagil türler genellikle karmaşık genom yapıları, baklagil özgü süreçlerinde hantal kilit rolü oynamak genlerin fonksiyonel çalışmalar yapma var. Öncelikle (1) bu nispeten küçük haploit genom büyüklüğündeki (~ 550 Mbp); ile diploit genom olduğundan Medicago truncatula yaygın bir modeli tür baklagil çalışmaları olarak kabul edilmiştir (2) bitkiler stabil gen fonksiyonel çalışmalar için dönüştürülebilir; ve (3) BT yonca (M. sativa), yemleri kraliçesi ve çevirim çalışmaları için pek çok ekonomik açıdan önemli bitkileri yakından ilgilidir. Son zamanlarda, genom dizisi M. truncatula cv Jemalong A17 yayımlanan1,2oldu. Orada 50.000’den fazla tahmin edilen gen veya gen modellerin genom genom kopyası ek açıklama göstermektedir. M. truncatula genlerinde çoğunun işlevi belirlemek için genom zorlu bir iştir. Genlerin fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmak için hızlı nötron bombardımanı (FNB) mutagenesis M. truncatula cv kullanarak kapsamlı bir koleksiyon 150.000 M1 satır aralığındaki mutantların oluşturuldu Jemalong A173 ,4. Hızlı nötron, yüksek enerji iyonlaşma alkil mutantlar Arabidopsis5,6, pirinç (Oryza sativa)7, domates (Solanum dahil olmak üzere birçok bitki türü oluşturmak için kullanılan lycopersicum), soya (Glycine soya; G. max)8,9, arpa (Hordeum vulgare) ve Lotus japonicus10. FNB mutagenesis türetilmiş mutasyonlar büyük bir bölümünü bu aralığı mega baz çifti9,11birkaç baz çiftinden boyutunda DNA silme nedeniyle vardır. Birçok fenotip ilişkili genlerin başarıyla olmuştur tespit ve4,12,13,14,15,16, ile karakterize 17 , 18 , 19. daha önce FNB mutantlar üzerinden temel genlerin Moleküler klonlama zaman alıcıdır ve moleküler düzeyde karakterize edilebilir mutantlar sayısını sınırlar harita dayalı yaklaşım dayanıyordu. Son zamanlarda, transkript tabanlı yöntemleri de dahil olmak üzere birkaç ücretsiz yaklaşım dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) DNA kopyalama numara varyasyon algılama ve tüm genom sıralama, fayans genom istihdam kolaylaştırmak için silme mutant hayvanlar ve bitkiler20,21,22,23,24,25de dahil olmak üzere çeşitli organizmalarda karakterizasyonu, 26,27,28,29,30,31.
M. truncatula, bir bütün-genom dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) FNB mutantlar karakterizasyonu kolaylaştırmak için platform geliştirilen doğrulanmış ve. Hayvan sistemlerinde bildirildiği gibi dizi tabanlı CGH platformu kopya numarası varyasyonları (CNVs) M. truncatula FNB mutantlar tüm genom düzeyindeki algılama sağlar. Ayrıca, lezyonlar PCR tarafından onaylanabilir ve silme sınırları sıralama tarafından belirlenebilir. Genel olarak, dizi CGH platformu M. truncatula FNB mutantlar lezyonlarının belirlenmesinde bir verimli ve etkili bir araçtır. Burada, dizi CGH yordam ve M. truncatula FNB mutant silme sınırların karakterizasyonu PCR gösterilmiştir.
Aşağıdaki iletişim kuralı tüm genom dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) analizi kopya sayının yerine getirirken ilgilenen araştırmacılar için deneysel adımlar ve reaktifler, ekipman ve çözümleme araçları hakkında bilgi sağlar bitkiler değişimler. Örnek olarak, Medicago truncatula FN6191 mutant silme bölgeler ve aday genleri mutasyona uğramış fenotipleri ile ilişkili tanımlamak için kullanıldı. M. truncatula FN6191 mutant, başlangıçta bir hızlı nötron bombardımanı kaynaklı silme mutant koleksiyonu32 izole (bakınız Tablo malzemeler), sergilenen bir hiper-nodulation fenotip toprak ile aşı sonra bakteri, vahşi türü bitkilerin aksine Sihorhizobium meliloti Sm1021.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir dizi tabanlı CGH platformu algılama ve hızlı nötron bombardımanı (FNB) karakterizasyonu için geliştirdiğimiz- M. truncatula cv. Jemalong A17 mutantlar indüklenen. Dizi içinde gen mutasyonlarının hafiye CGH yöntemi kullanımını göstermek için mutant S. meliloti Sm1021ile aşılanmış zaman vahşi türü bitkiler, aksine bir hiper-nodulation fenotip sergilenen FN6191 aCGH analizi yapılır. Segmentasyon analiz için bir kesimi, günlük2 oranı demek segmentte probları …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser finansman bir grant tarafından kısmen NSF bitki genom araştırmaları (IOS-1127155) sağlanır.
Materials
| Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M | Agilent | G4123A | |
| Medicago truncatula FN6191 (mutant) | In house | FN6191 | |
| Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) | In house | A17 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | 1000D | |
| SureTag DNA Labeling Kit | Agilent | 5190-3400 | |
| Random primer | Agilent | 5190-3399 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
| Thermocycler | MJ research | PTC-200 | |
| Centrifuge | Labnet international Inc | Spectrafuge 24D | |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | 5185-5979 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | 5188-5380 | |
| Hybridization Chamber gasket slides | Agilent | G2505 | |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | 5190-3393 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 | Agilent | 5188-5221 | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | G2534A | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | |
| Purification Columns | Agilent | 5190-3391 | |
| Laser scanner | Roche | MS200 | |
| NimbleScan 2.6 | Roche Nimblegen | 5225035001 | |
| Signal Map 1.9 | Roche Nimblegen | Signalmap1.9 |
References
- Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Wang, H., Li, G., Chen, R., da Silva, J. T. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. , 629-639 (2006).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
- Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
- Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
- Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
- Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
- Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
- Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
- Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
- Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
- Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
- Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
- Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
- Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
- Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
- Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
- Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
- Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
- Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
- Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
- Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
- Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
- Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. 遗传学. 165 (4), 1745-1759 (2003).
- Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
- Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
- Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
- Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
- Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
- Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
- Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
- Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
- Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
- Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
- . Medicago truncatula Mutant Database Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017)
- Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).
