Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un buon modello per studiare il trasporto assonale e intracellulare. Qui, descrivo un protocollo per la registrazione in vivo e l’analisi del trasporto assonale e intraflagellare c.elegans.
Trasporto assonale e trasporto intraflagellare (IFT) sono essenziali per la funzione e la morfogenesi dell’assone e le ciglia. Dineina e chinesina superfamiglia delle proteine sono motori molecolari che regolano anterograda e retrograda trasporto, rispettivamente. Questi motori utilizzano microtubule network come rotaie. Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un organismo potente modello per studiare il trasporto assonale e IFT in vivo. Qui, descrivo un protocollo per osservare il trasporto assonale e IFT nella vita di c. elegans. Merce trasportata può essere visualizzato mediante codifica proteine cargo utilizzando proteine fluorescenti come proteina fluorescente verde (GFP). C. elegans è trasparente e proteine GFP-etichettato cargo possono essere espresso in cellule specifiche sotto promotori di cellula-specifico. Viti senza fine viventi possono essere risolto microsfere su gel di agarosio 10% senza uccidere o anestetizzare i vermi. In queste condizioni, movimento di carico può essere osservato direttamente negli assoni e ciglia di vivere c. elegans senza dissezione. Questo metodo può essere applicato per l’osservazione di qualsiasi molecola di carico in tutte le cellule modificando proteine bersaglio e/o le cellule in che si sono espressi. Le proteine più elementari quali motori molecolari e proteine adattatrici che sono coinvolti nel trasporto assonale e IFT sono conservate in c. elegans. Rispetto ad altri organismi di modello, mutanti possono essere ottenute e mantenute più facilmente in c. elegans. Combinando questo metodo con vari mutanti di c. elegans può chiarire i meccanismi molecolari del trasporto assonale e IFT.
Live cell imaging è uno strumento essenziale per l’analisi di trasporto intracellulare. Nella biologia delle cellule neuronali, sono essenziali per comprendere la funzione e la morfogenesi neuronale1analisi del trasporto assonale con formazione immagine di cellule vive. Difetti nel trasporto assonale sono alla base di disordini neurodegenerative diversi2. Dineina e chinesina superfamiglia proteine svolgere trasporto assonale anterograda e retrogradely, rispettivamente1,2.
Le ciglia sono un altro compartimento cellulare in cui la rete dei microtubuli e traffico macchine sono altamente sviluppato3. Macchinario di sintesi proteica non è localizzata nelle ciglia, il che significa che ciliare proteine devono essere trasportati dal citoplasma verso le punte di ciglia. Cilia-specifiche chinesina e dineina, chiamato chinesina-2 e citoplasmatici dineina-2, rispettivamente, i componenti di ciglia4, in un fenomeno chiamato trasporto intraflagellare (IFT)5di trasporto. Il danno dell’IFT causa uno spettro di malattie chiamate ciliopatie6. Così, per capire i meccanismi di base della formazione ciliare e la patogenesi sono necessaria analisi del meccanismo IFT da formazione immagine di cellule vive.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un buon modello per studiare il trasporto assonale e IFT7,8,9. Per osservare IFT, Chlamydomonas è stato ampiamente utilizzato come organismo modello5,6. Essendo un organismo unicellulare Chlamydomonas , il rapporto dell’IFT con invecchiamento, funzione di un neurone e comportamento sarebbe difficile da analizzare. Inoltre, tecniche di genetiche essenziale come CRISPR/Cas9 non siano state applicate a Chlamydomonas. Negli più alti organismi di modello, come topi e Drosophila, interruzione del trasporto assonale e IFT spesso provoca fenotipi letali perché trasporto assonale e IFT sono essenziali per la morfogenesi e l’omeostasi del animali 10, 11. Nel caso di topi, trasfezione e coltura delle cellule è generalmente necessario osservare trasporto assonale e IFT, che richiede molte competenze e tempo estesa12,13. Inoltre, un sacco di contesto fisiologico importante può essere perso in linee cellulari e cellule coltivate. Poiché il sistema nervoso non è essenziale per la sopravvivenza dei vermi, c. elegans mutanti in cui trasporto assonale o IFT sono interrotti non sono spesso letali7,9,14. Trasporto assonale e IFT può essere osservato direttamente in vivo senza dissezione perché c. elegans è trasparente ed è quindi facile osservare GFP-etichettato marcatori.
Esistono diversi protocolli per immobilizzare c. elegans, come l’utilizzo di un dispositivo di microfluidica15, pastiglie di agarosio con anestesia16o microsfere17. L’inclusione dell’anestesia può inibire gli eventi traffici in neuroni15. Un chiaro svantaggio del metodo microfluidici-periferica è che preparando un dispositivo microfluidico non è sempre facile. Invece, l’immobilizzazione di agarosio pastiglie e microsfere è un modo conveniente e facile per eseguire imaging lasso di tempo in c. elegans. Qui, descrivo questo protocollo di base per immobilizzare c. elegans e visualizzare trasporto assonale e IFT in vivo in elegans del c. Rispetto agli altri metodi, il metodo qui descritto non richiede attrezzature speciali ed è molto più economico e più facile da eseguire.
Limitazione per quanto riguarda i metodi esistenti
Il metodo qui descritto è ottimizzato per osservare eventi veloci come trasporto assonale e IFT. Così, l’immobilizzazione è più una priorità di incubazione più lungo. Mentre siamo stati in grado di osservare eventi di traffici per almeno 20 min senza perturbazione significativa, questo metodo potrebbe non essere sempre adatto per osservare eventi lenti che richiedono osservazioni più lungo, ad esempio allungamento dell’assone e migrazione cellu…
The authors have nothing to disclose.
L’autore ringrazia profondamente Dr. Asako Sugimoto (Università di Tohoku) per la sua discussione utile. wyIs251 era un dono generoso da Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 è stato fornito dalla CGC, che è finanziato dall’ufficio di NIH di programmi di ricerca dell’infrastruttura (P40 OD010440). Questo lavoro è stato supportato da grant JSPS KAKENHI #17 H 05010 e #16 H 06536 e Fondazione di Daiichi Sankyo, Brain Science Foundation e Naito Foundation.
Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
Agarose | Wako | 318-01195 | |
Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |