ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי
Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש מכשיר microfluidic אוטומטית להתאמה אישית כדי להמחיש ביופילמים ב קנדידה אלביקנס בתנאים פיזיולוגיים המארח.
Abstract
קנדידה אלביקנס היא המחלה פטרייתי הנפוץ ביותר של בני האדם, גורם כ 15% של המקרים רכשה החולים אלח דם. תכונה התקפה אלימה העיקריים של ג אלביקנס הוא היכולת ליצור biofilms שלה, קהילות מובנית של תאים מחוברת משטחים ביוטיים והאביוטיים. Biofilms ג אלביקנס יכולים ליצור רקמות מארח, כגון שכבות הרירית, ועוד מכשירים רפואיים, כגון קטטרים, קוצבי, שיניים תותבות, תותבות משותפת. Biofilms מהוות אתגרים משמעותיים קלינית כי הם עמידים מאוד בפני לפליטת פיזיקליות, כימיות, ויש לפעול כפי מאגרים זרע המופץ זיהומים. מבחני במבחנה שונים כבר נעזרו ללמוד אלביקנס ג ביופילמים, כגון מבחני צלחת microtiter, מדידות משקל יבש, מבחני הכדאיות תא קונפוקלית לייזר סריקה. כל מבחני אלה הם מבחני מובילים בודד, היכן שקובעת ביופילמים בנקודת זמן מסוימת. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ללמוד ביופילמים בזמן אמת באמצעות מכשיר microfluidic אוטומטית תחת תנאי זרימה שכבתית. שיטה זו מאפשרת התבוננות ביופילמים כפי biofilm מתפתחת עם הזמן, שימוש להתאמה אישית בתנאים המחקים את אלה של המחשב המארח, כגון אלה המצויים קטטרים לכלי הדם. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך את הליקויים biofilm של מוטציות גנטיות וכן אפקטים המעכבת של סוכני מיקרוביאלית על פיתוח biofilm בזמן אמת.
Introduction
קנדידה אלביקנס הוא חבר commensal microbiota האנושית, אולם זה גם פתוגן הזדמנותית, מסוגל לגרום זיהומים פטרייתיים שטחית וחמור1,2. תכונה התקפה אלימה העיקריים של ג אלביקנס היא יכולתה להעביר טופס גמיש, biofilms עמידים בפני התרופה, קהילות של תאים דבקה משטח המוקף בסוגריים גשמי1,מטריצה חוץ-תאית3. ג אלביקנס biofilms בנויות מאוד, המכיל מספר שכבות של סוגי תאים מרובים (סיבוב ניצני שמרים-טופס תאים, התאים pseudohyphal אובל ותאים hyphal צינורי)4. פיתוח biofilm אלביקנס ג מתחיל עם הדבקות של תאי שמרים עגולה-טופס משטח (זריעה של biofilm), ואחריו ההתפשטות של תאים אלה על פני השטח ולאחר מכן ההבשלה של biofilm ילדותי מבנה לתוך biofilm מלא שנוצר המוקפת מטריצה חוץ-תאית גשמי4. בוגרת biofilm מורכב בעיקר מוארך התאים hyphal היוצרים רשתות צפופות ולא מחוברים, מספקת את היציבות אדריכלי עד biofilm4. לאורך כל מחזור חיי biofilm, עגול ניצני שמרים תאים לפזר מן biofilm בוגרת, עשוי לטייל באזורים אחרים של הגוף כדי לגרום לזיהומים המופץ או זרע biofilms חדש על אתרים אחרים,4,5. ג אלביקנס יכולים ליצור biofilms על משטחים ביוטיים, כגון משטחים הרירית וברחבי רקמות הפונדקאי, ועל משטחים והאביוטיים, כגון קטטרים, קוצבי, שיניים תותבות, המפרקים תותבת. בשל מאפייני biofilms הסרבן, הם קשים מאוד לשרש, במקרים רבים אסטרטגיית טיפול יעיל רק הסרה של התקן נגוע4. לכן חשוב לחקור ביופילמים בתנאים דומים לאלה הנהוגות הגדרות קליניים.
ישנם כמה קריטי ויוו חייתיים המשמשות ללימוד אלביקנס ג biofilm היווצרות6,7,8; עם זאת, מחקרים אלה יכול להיות יקר, זמן רב, מוגבלים על ידי מספר זנים, סוכני מיקרוביאלית יכול להיבדק בזמן נתון. במבחנה biofilm מבחני, מצד שני, לאפשר ההערכה המהירה, תפוקה גבוהה של תרכובות פטריות מוטציה זנים, והם הרבה יותר חסכונית, אתי מבחני biofilm נשא שם חיה מודלים9, 10,11,12,13,14. כאן נתאר assay במבחנה אנו פיתח, אופטימיזציה להתבונן ביופילמים חנותם תחת זרימה שכבתית באמצעות14,התקן15microfluidic להתאמה אישית. וזמינותו מאפשר החזיית בכל שלב של ביופילמים, כולל את שלב הדבקות ראשונית, התפשטות תאים, ההבשלה biofilm תא פיזור. וזמינותו שימושי גם לדמיין תא מורפולוגיה שינויים במהלך התפתחות ממבנה biofilm.
לוחות Microtiter, אשר בדרך כלל מנוצלים עבור במבחנה biofilm מבחני, בעוד תפוקה גבוהה, אינם מאפשרים תנאים זרימה מבוקרת. מסורתי, תא מנדפים תאפשר להערכה מתמשכת של ביופילמים בתנאי זרימה מבוקרת, אך אלה הם לעתים קרובות זמן רב כדי להגדיר, נוטים מוגבל טווח דינמי שליטה והתפוקה. המכשיר microfluidic מנוצל כאן מתגבר על מגבלות אלה על-ידי שילוב לוחות תפוקה גבוהה (מכיל 48 וולס) עם תא זרימה שכבתית מובנה, היא מאוד לשחזור, תכליתי, הניתנים להתאמה אישית.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לשימוש של מכשיר microfluidic אוטומטיים זמינים מסחרית כדי להעריך ביופילמים של פראי-סוג אלביקנס ג להתאמץ, את ההשפעות של סוכן פטריות ידוע על הפיתוח של biofilm ו biofilm -צורה שני זנים מוטציה (Δbcr1/Δ וδ efg1/Δ) אשר היו בעבר דווח כי biofilm פגמים במבחנה , ויוו16,17,18. הפרוטוקול המתואר ניתן לבדוק את היעילות של סוכני מיקרוביאלית עיכוב ביופילמים במהלך התפתחות ממבנה biofilm, וכדי לזהות גנים הדרושים לפיתוח biofilm רגילה על-ידי הקרנת ספריות מוטציה.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microfluidic להתאמה אישית biofilm וזמינותו המתוארים כאן מאפשר החזיית ביופילמים ב בזמן אמת ברמה תא בודד כאשר הם נחשפים זרימה שכבתית בריבית קבועה עם טמפרטורה קבועה. הוא מספק אמצעי רב עוצמה כדי ללמוד על התפתחות biofilms בפראי-סוג של מוטציה זנים, ההשפעות של הסוכן מיקרוביאלית טיפולים על biofilms בתנאים המחקים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכל חברי המעבדה Nobile לדיונים מועיל על מבחני biofilm. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענק R21 AI125801 (C.J.N.). D.L.R. נתמכה על ידי מלגת דוקטורט מאוניברסיטת קליפורניה המכון מקסיקו, ארצות הברית (UC-MEXUS) ו y Consejo נאסיונאל דה Ciencia Technologia (CONACYT).
Materials
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
References
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
- Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
- Fox, E. P., Nobile, C. J., Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. . Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. , 1-24 (2013).
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
- Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
- Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
- Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
- Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
- Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
- Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
- Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
- Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Baker, K. . At the bench: A laboratory navigator. 27, (2005).
