Identificação de OTX1 e OTX2 como duas possíveis marcadores moleculares para Carcinomas Nasossinusal e Neuroblastomas olfativas
Summary
Genes homeobox são genes regulatórios, frequentemente associados com tumores nos organismos adultos. Nós investigamos sua expressão comparativa por imuno-histoquímica e análise PCR em tempo real, na mucosa nasal normal e inflamatória e em neoplasias Nasossinusal para utilizá-los como possíveis alvos de diagnósticos e terapêuticos.
Abstract
Genes homeobox (HB) de OTX são expressos durante a morfogênese embrionária e durante o desenvolvimento do epitélio olfatório em organismos adultos. Mutações ocorrem nestes genes estão muitas vezes relacionadas a tumorigênese em humanos. Não existem dados hoje sobre a possível correlação entre genes OTX e tumores da cavidade nasal. O objetivo deste trabalho é entender se OTX1 e OTX2 podem ser considerado como marcadores moleculares no desenvolvimento de tumores nasais. Nós selecionamos adenocarcinomas nasais e Nasossinusal para investigar a expressão dos genes OTX1 e OTX2 através de imuno-histoquímica e análises PCR em tempo real. Tanto OTX1 como OTX2 estavam ausentes em todas as amostras de Nasossinusal Adenocarcinomas Intestinal-tipo (ITACs). OTX1 mRNA foi identificado apenas em Non-Intestinal tipo Adenocarcinomas (NITACs), enquanto OTX2 mRNA foi expressa somente em Neuroblastomas olfativo (ONs). Nós demonstramos que a expressão diferencial do gene para ambos OTX1 e OTX2 genes pode ser um útil marcador molecular para distinguir os diferentes tipos de tumores Nasossinusal.
Introduction
OTX HB genes são o vertebrados homólogo dos genes orthodenticle da drosófila (otd) e eles codificam para fatores de transcrição que normalmente são expressos durante a morfogénese embrionária, mas eles também podem ser expressos no organismo adulto com diferentes funções . Durante o desenvolvimento embrionário, eles controlam a especificação de identidade celular, diferenciação celular e o posicionamento do axis¹ corpo. A família OTX inclui genes OTX1 e OTX2 , que exibem diferentes funções. OTX1 está envolvida no cérebro e desenvolvimento de órgãos sensoriais. No organismo adulto, que é expresso em órgãos sensoriais e é transcrito em níveis baixos no lobo anterior da hipófise2; também desempenha um papel na hematopoiese, sendo expressa em hematopoiéticas pluripotentes e de células progenitoras3. OTX2 está envolvida no desenvolvimento da cabeça rostral e seus atos de proteína traduzida como um morphogen porque ele gera um gradiente através do quais outros genes são ativados ou reprimidos de forma espaço-temporal, contribuindo assim para a célula proliferação e diferenciação. No organismo adulto, OTX2 é encontrado exclusivamente na glândula pineal e do plexo coroide4.
Mutações nos genes OTX estão muitas vezes relacionadas com o aparecimento de defeitos metabólicos, congênitos ou somáticos humanos. Ganho ou perda de mutações em genes OTX poderiam promover a tumorigênese, se eles não são capazes de controlar corretamente de crescimento e/ou diferenciação celular5. Em leucemias e linfomas, bem como em muitos tumores sólidos (por exemplo, Meduloblastomas6, agressivo linfomas não-Hodgkin2, carcinomas de mama7, cancros colo-rectais8e retinoblastoma9), o desregulamentado expressão de genes de HB OTX é bem documentado10. Além disso, as mutações de OTX2 foram demonstradas em casos de anophthalmia e microphtalmia11 , devido ao papel crucial para este gene no controle do desenvolvimento do olho.
No contexto de neoplasias sólidas, a descoberta de marcadores moleculares e fenotípicos é um desafio importante para o diagnóstico, classificação e tratamento de vários tipos de tumor11, incluindo aqueles que se originam na cavidade nasal e seios paranasais seios paranasais. Na verdade, apesar de que estas áreas ocupam apenas um modesto espaço anatômico, epitélio da mucosa, glândulas, tecidos moles, osso, cartilagem ou neural/neuroectodérmico, e hematolymphoid as células podem ser frequentemente o local para a origem do complexo e histologicamente diferentes grupos de tumores. Diferentes tipos de neoplasias envolvendo o trato Nasossinusal apresentam uma variedade de características que superar o que geralmente é visto no tracto aerodigestive superior ou mesmo durante a maioria das partes do corpo12. Neoplasias malignas Nasossinusal são raras e apresentam uma incidência anual de 1: 100.000 habitantes em todo o mundo, e então isso impede que estudos sobre as vias envolvidas na tumorigênese e à análise das estratégias de tratamento alternativo. Apesar disso, os avanços em imagens técnicas, as abordagens cirúrgicas e radioterapia têm melhorado o manejo clínico de câncer Nasossinusal. Além disso, o desenvolvimento de linhas de células, bem como modelos animais e perfis genéticos do câncer atualmente constituem a base para a futura terapias anticâncer alvo13. Até à data, não existem relatos sobre OTX1 e/ou OTX2 expressão em neoplasias da cavidade nasal, nasofaringe e seios paranasais. Já observamos anteriormente que OTX1 e OTX2 estão envolvidos no câncer de mama7, gostaríamos de saber se estes genes poderiam estar presentes não só na mucosa nasal normal, mas também em tumores da cavidade nasal. Para atingir este objetivo, que temos obtidos a partir do “Ospedale di Circolo” em amostras de Varese de mucosa normal e adenocarcinomas nasais e Nasossinusal coletados de 1985 para 2012 e classificados de acordo com a Organização Mundial de saúde (OMS), o departamento de patologia classificação dos tumores de pescoço e cabeça. Optamos por analisá-los através de análises em tempo real do PCR e imuno-histoquímica e avaliamos a expressão OTX1 e OTX2 para determinar se eles podem ser considerados marcadores moleculares para estes tipos de tumores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudo mostra pela primeira vez que, com base nos níveis de RNAm, os genes HB OTX1 e OTX2 são expressas em mucosa Nasossinusal normal e glândulas submucosas, pólipos inflamatórios, Nasossinusal Schneiderian papilomas e em diferentes epiteliais e Neuroectodérmicos Neoplasias, incluindo carcinomas escamosos, tipo não-intestinal Nasossinusal adenocarcinomas, tumores de glândulas salivares-tipo, neoplasias neuroendócrinas e ONs.
Modificações e solução de problemas:
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Grandi Strumenti Università dell’Insubria, Fondazione Comunitaria del Varesotto, Fondazione del Monte di Lombardia e e Fondazione Anna Villa Felice Rusconi.
Materials
| RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation | Applied Biosystem | AM1975 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystem | 4326614 | |
| ABI Prism 7000 | Applied Biosystem | 270001857 | |
| ACTB probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX1 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX2 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| Acqueous Hydrogen Peroxide | Merk | 1072090250 | |
| Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | 20276292 | |
| Triton | Sigma-Aldrich | 101473728 | |
| Tris | Merk | 108382 | |
| NaCl | Merk | 106404 | |
| Goat Anti-OTX2 Antibody | Vector Laboratories | Out of production. Catalog number not available | |
| Rabbit Anti-Goat Antibody | Vector Laboratories | BA5000 | |
| ABC-Peroxidase Complex | Vector Laboratories | PK6100 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB) | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Harris Hematoxylin | Bioptica | 0506004/L | |
| Pertek | Kaltek SRL | 1560 | |
| BioClear | Bioptica | W01030799 |
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