Summary
بروتوكولات جديدة ويرد هنا لعزل وتوصيف المجهرية الدقيقة المستمدة من الإنسان والفأر العَدلات. استخدام هذه البروتوكولات تنبيذ فائق، والتدفق الخلوي والتقنيات إيمونوبلوتينج لتحليل محتوى يمثل، ويمكن استخدامها لدراسة دور المجهرية الدقيقة المستمدة من مختلف أنواع الخلايا في وظيفة الخلوية.
Abstract
المجهرية الدقيقة النوى المستمدة من العَدلات (المجنحة)-MPs) الدهن بلير، ميكروفيسيكليس كروية بأحجام تتراوح بين 50 – 1,000 شمال البحر الأبيض المتوسط في القطر. نحو النواب الناشئة حديثا، وجزءاً هاما من خلية إلى خلية الاتصال وإرسال الإشارات إليه. بسبب حجمها وطبيعة الإفراج عنهم، تم إغفال وجود النائب حتى وقت قريب. ومع ذلك، مع تحسين التكنولوجيا والأساليب التحليلية الآن يبرز وظيفتها في الصحة والمرض. هي البروتوكولات المقدمة هنا تهدف إلى عزل ووصف النواب المجنحة التدفق الخلوي وإيمونوبلوتينج. وعلاوة على ذلك، يتم إعطاء أمثلة عدة على التنفيذ. هذه البروتوكولات لعزل النائب سريعة ومنخفضة التكلفة، ولا تتطلب استخدام معدات باهظة الثمن. وعلاوة على ذلك، أنها تسمح لتسمية أعضاء البرلمان بعد العزلة، فضلا عن وضع العلامات مسبقاً من الخلايا المصدر قبل الإفراج عن النائب، استخدام صبغة فلورسنت الخاصة بغشاء للتصور والتحليل عن طريق التدفق الخلوي. ومع ذلك، قد هذه الطرق، العديد من القيود بما في ذلك النقاء بمنس وأعضاء البرلمان والحاجة إلى الأدوات التحليلية المتطورة. Cytometer تدفق الراقية مطلوب لتحليل MPs موثوق بها والتقليل من قراءة إيجابية كاذبة بسبب الضوضاء أو السيارات-الأسفار. البروتوكولات وصف يمكن استخدامها لعزل وتعريف النائب نشوء حيوي، وتميز علامات والاختلاف في تكوين ظروف محفزة مختلفة. تباين حجم يمكن استغلالها للتحقيق في ما إذا كان محتوى جزيئات الغشاء مقابل اكسوسوميس مختلفة، وما إذا كان أنها تفي بأدوار مختلفة في الأنسجة التوازن. وأخيراً، يمكن استكشاف عزل وتوصيف لأعضاء البرلمان، ووظيفتها في الاستجابات الخلوية ونماذج مختلفة من المرض (بما في ذلك، اضطرابات الالتهابات المرتبطة المجنحة، مثل أمراض الأمعاء الملتهبة أو إصابة الرئة الحاد) التالية.
Introduction
في الآونة الأخيرة، أصبحت "المجهرية الدقيقة/ميكروفيسيكليس" مصدرها سيتوسول الخلية أو غشاء البلازما ذات أهمية علمية كبيرة، كما تشير البيانات الناشئة أن هذه الهياكل، وتتراوح بين 50-1,000 شمال البحر الأبيض المتوسط في القطر، ويمكن أن تحمل المعلومات البيولوجية و بمثابة وسيلة غير مقبول للاتصالات الخلوية. المناعية الخلية المستمدة من أعضاء البرلمان، ولا سيما تلك التي تنتجها العَدلات النوى (بمنس) ذات أهمية كبيرة نظراً للدور الهام بمنس في المضيف الدفاع1،2، الردود الملتهبة3، والتئام الجروح 4-الفضول، حتى الآن، أظهرت تقارير عديدة وظائف كل برو-التهابات والالتهابات من النواب المجنحة5، مما يوحي سياق المحتملة-والمرض-والأنواع-والدور الخاصة بالجهاز من أعضاء البرلمان.
توفر البروتوكولات الموصوفة في هذه الاتصالات وسيلة فعالة من حيث التكلفة ومبتكرة وقابلة للتكيف لدراسة وظيفة البرلمان في الصحة والمرض. وتنطبق على العديد من الكائنات النموذجي، والأجهزة، وشروط التحفيز. أنها تسمح للتعرف على أنواع عدة من أعضاء البرلمان، ويمكن استخدامها في المستقبل للتصدي لمهامها برو-التهابات والالتهابات. على سبيل مثال، وصف هنا كيف يمكن لدراسة وظيفة MPs المجنحة في الجرح الظهارية الشفاء في المختبر و في فيفو. البروتوكول المقدم لعزل الماوس بمنس المشتقة من نخاع العظم تم تكييفها مع بعض التعديلات من أسلوب هو موضح سابقا6.
وعلاوة على ذلك، تسمح البروتوكولات المذكورة في هذه الدراسة لكشف وتوصيف علامات محددة التي يمكن العثور على أعضاء البرلمان المجنحة بطريقتين تكمل: الغربية لطخة والتدفق الخلوي. ونجد أن إيمونوبلوتينج من أعضاء البرلمان باستخدام البروتوكولات القياسية5 سهلة ويمكن الاعتماد عليها، إلا أن التقدم الذي أحرز مؤخرا في حساسية أدوات قياس التدفق، ونسبة الضجيج إلى إشارة أفضل تسمح الآن لمزيد من التحليل لأعضاء البرلمان باستخدام هذا الأسلوب. تتضمن البروتوكولات الموصوفة في هذه الدراسة التطورات الأخيرة والتوصيات من المقالات والبحوث الأصلية، بما في ذلك إدخال تعديلات على سرعة الطرد المركزي، والوقت، إضافة نموذج التصفية وتجميد/تخزين شروط7 , 8، وكيفية الحد من "ضجيج الخلفية"، وتحسين حد الكشف لأعضاء البرلمان المجنحة، وتميز بين الأحجام المختلفة لأعضاء البرلمان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأقر جميع أعمال الحيوان IACUC شمال غرب البلاد. وأنجزت جميع التجارب وفقا والامتثال لجميع المبادئ التوجيهية التنظيمية والمؤسسية ذات الصلة. للبشر التبرع بالدم، قدمت موافقة واعية ووقعت؛ وباﻹضافة إلى ذلك، تعامل جميع البشر في هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية الاتحادية والمؤسسية لرفاهية الإنسان.
ملاحظة: يتم سرد الخطوات البروتوكول تحت الأقسام الفرعية التالية: (ط) "عزل خلية نخاع العظم الماوس"؛ (ثانيا) المجنحة "العزلة" من نخاع العظام مورين؛ (ثالثا) المجنحة "في معزل" عن "الدم البشري"؛ (رابعا) النائب في معزل عن Supernatants المجنحة (بواسطة تنبيذ فائق)؛ (v) الوصف من أعضاء البرلمان من "النشاف الغربية"؛ (سادسا) وصف لأعضاء البرلمان بالتدفق الخلوي؛ (ثامنا) تطبيق MPs معزولة "الجرح شفاء الدراسة"
1-الماوس عزل خلية نخاع العظام
-
تشريح عظم الفخذ والساق من الخلفيتين الماوس
- إعداد مربع القتل رحيم (مثلاً، شكل مربع تلميح فارغة 1 مل) لاستنشاق للتخدير. إضافة بضع قطرات من إيسوفلوراني 100% على قطعة قماش معقمة مسجلة إلى داخل غطاء علبة بلاستيكية. وفقا للمبادئ التوجيهية الجديدة في إياكوك، ينبغي أن لا تأتي في اتصال مباشر مع إيسوفلوراني الحيوانات، وبالتالي وضع حامل نصيحة بين الماوس والشاش الذي يحتوي على إيسوفلوراني.
ملاحظة: إيسوفلوراني مخدر استنشاق قوية وينبغي التعامل معها بحذر شديد داخل غطاء دخان. - Euthanize الفئران وفقا للتوصية إياكوك. ضع ماوس داخل مربع القتل الرحيم الموصوفة في الخطوة 1 – 5 دقائق 1.1.1 حتى أنه قد توقف عن التنفس. التأكد من وفاة الحيوان بأداء اضطراب عنق الرحم.
- رفع الجلد البطن باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ، 12 سم منحنى، ملاقط 0.17 ملم × 0.1 ملم وقطع الجلد في منتصف الطريق بين الأطراف العليا والسفلي. قشر الجلد من هنا إلى قسم آخر القاصي الماوس الجسم بما في ذلك السفلية. مع 10 سم طويل، مستقيم تشريح مقص، إزالة العضلات من الخلفيتين وانخلاع الورك المساس برأس عظم الفخذ.
- استخدام مقص لتشريح العضلات من عظم الفخذ والساق وفصل عظم الفخذ من الساق. تأكد من نهايات العظام تبقى على حالها كما أنها تحتوي على كميات كبيرة من نخاع العظام.
- إزالة جميع اللحم المتبقية قبل المتداول العظام داخل منشفة ورقية. ضع عظام نظيفة في طبق بتري يحتوي على "المتوسط" خالية من المصل (الإدارة المستدامة للغابات، أي، المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو (دميم) دون المصل أو المضادات الحيوية).
- شطف العظام في الإيثانول 70%، ومن ثم في الإدارة المستدامة للغابات.
- إعداد 50 مل من الإدارة المستدامة للغابات في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. تحميل 10 مل من الإدارة المستدامة للغابات في حقنه 10 مل وإرفاقه بإبرة قياس 25 و 5/8 بوصة.
- تقليم نهاية العظام مع مقص حتى مرئياً افتتاحي لنخاع العظام (حمراء اللون).
- مسح خلايا نخاع العظام في أنبوب 50 مل جديدة. استخدم حقنه 10 مل بإبرة قياس 26 و 5/8 بوصة مع حوالي 3 مل/العظام للإدارة المستدامة للغابات. عند الانتهاء من التنظيف، ريسوسبيند الخلايا في الأنبوب من بيبيتينج (استخدام المتاح 1 مل نصائح البلاستيك) لكسر المجاميع الخلية.
- إعداد مربع القتل رحيم (مثلاً، شكل مربع تلميح فارغة 1 مل) لاستنشاق للتخدير. إضافة بضع قطرات من إيسوفلوراني 100% على قطعة قماش معقمة مسجلة إلى داخل غطاء علبة بلاستيكية. وفقا للمبادئ التوجيهية الجديدة في إياكوك، ينبغي أن لا تأتي في اتصال مباشر مع إيسوفلوراني الحيوانات، وبالتالي وضع حامل نصيحة بين الماوس والشاش الذي يحتوي على إيسوفلوراني.
2-المجنحة في معزل عن مورين نخاع العظام
-
تحلل الخلايا الحمراء
- بيليه نخاع العظام التي تم جمعها من سينتريفوجينج في 350 x ز لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 20 مل من 0.2% كلوريد الصوديوم لحوالي 20-30 ثانية في كسر كرات الدم الحمراء. لا تتجاوز 30 ثانية كهذا سيؤدي إلى تفسخ المجنحة. إضافة 20 مل من 1.6% كلوريد الصوديوم لاستعادة أوسمولاليتي.
ملاحظة: قد تؤدي هذه الخطوة إلى تنشيط المجنحة القليل جداً. - تغسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 2.1.1 أعلاه. إزالة المادة طافية.
- المضي قدما لعزل بمنس بكثافة التدرج الطرد المركزي.
-
عزل العَدلات بكثافة التدرج الطرد المركزي
- الحارة بوليسوكروسي والصوديوم دياتريزواتي الحلول، مع كثافة 1.119 غ/مل و 1.077 غ/مل (انظر الجدول للمواد)، إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام.
- إعداد بوليسوكروسي والصوديوم دياتريزواتي تدرجات جديدة، مباشرة قبل تطبيق خلية نخاع العظام ببطء طبقات مل 3 من محلول كثافة 1.077 غ/مل أكثر من 3 مل حل الكثافة 1.119 غ/مل في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل.
ملاحظة: سيؤدي إلى إعداد الحل التدرج بعيداً جداً في وقت مبكر في الخلط بين الطبقات ونقاء العَدلات الفقيرة والانتعاش. - ريسوسبيند بيليه خلية نخاع العظام في 1 مل من برنامج تلفزيوني المثلج وتراكب تعليق الخلية الناتجة على رأس دياتريزواتي بوليسوكروسي والصوديوم التدرج (ببطء، لتجنب الخلط بين الطبقات).
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 850 x ز عند 25 درجة مئوية في الرايت، دون الفرامل. الحفاظ الكواشف في RT للفصل الفعلي العَدلات من الخلايا الأخرى الموجودة في نخاع العظام. تعيين أجهزة الطرد المركزي في التباطؤ بطيء للسماح للتدرج شكلت كفاءة والحفاظ عليها بعد خطوة الطرد المركزي.
- موقع بصريا طبقة خلايا وحيدات النوى في واجهة برنامج تلفزيوني وحل الكثافة 1.077 غ/مل (الطبقة العليا). إزالة هذه الطبقة وبقية الحل الكثافة دون إزعاج الفرقة المجنحة.
- جمع طبقة المجنحة بأكملها وبعض بوليسوكروسي الأساسية والحل 1.119 غ/مل دياتريزواتي الصوديوم في 15 مل أنابيب استخدام ماصة نقل.
ملاحظة: نقاء بمنس معزولة سيتوقف على إزالة كاملة من الطبقة العليا. - أعلى الأنابيب مع المصفاة PBS (التي تمت تصفيتها من خلال مرشح حجم مسام 0.1 ميكرومتر) وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية.
- أغسل بمنس الأعلاف مع 2 مل من برنامج تلفزيوني استخدام شروط الطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 2.2.7.
- ريسوسبيند في 1 مل من برنامج تلفزيوني تم تصفيتها وتعول بمنس معزولة من هيموسيتوميتير.
ملاحظة: لاستخدام هذا الأسلوب في العزلة، نقاء المجنحة الناتجة عن المبالغ إلى ~ 85-90 في المائة، كما كان يقيمها التدفق الخلوي. تلوث الكسور الباقية يتكون أساسا من اللمفاويات وحيدات النوى.
-
التحفيز المجنحة للحث على الإفراج عن النائب
ملاحظة: يمكن حفز بمنس للإفراج عن أعضاء البرلمان باستخدام شروط تفعيل مختلف، بما في ذلك نفورميللميثيونيلليوسيللفينيلالانيني (فملف)، فوربول-12-ميريستاتي-13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) أو الانترفيرون غاما (IFNγ). ومن المهم قبل المحاكاة، ينبغي إبقاء بمنس على الجليد في جميع الأوقات.- تصفية بمنس بيليه (300 x ز, 5 دقيقة, 4 درجة مئوية) وريسوسبيند في 0.1 ميكرومتر "موازنة الملح" الحل (حبس) الحل هانك، التي تحتوي على عامل حفز للاختيار. للتحفيز الأمثل، واستخدام 100 ميليلتر التحفيز الحل الواحد بمنس 10 مليون لمدة 20-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في أنابيب 15 مل.
ملاحظة: استخدمت تركيزات التالية لتفعيل بنجاح في أعمالنا السابقة: فملف (0.5-1 ميكرومتر للإنسان و 2-5 ميكرومتر للماوس بمنس)، سلطة النقد الفلسطينية (200 nM)، و IFNγ (100 نانوغرام/ملليلتر). إذا كان المطلوب هو إطلاق سراح أعضاء البرلمان السابق المسمى، احتضان بمنس unstimulated (1-5 × 106) مع N-(2-aminoethyl) ماليميدي-فيتك (انظر الجدول للمواد) (1 ميكرومتر في 100 ميليلتر هبس، 15 دقيقة، 37 درجة مئوية). المضي قدما في خطوات 2.3.1-2.3.3. - تدور في 850 x ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية، لإزالة بمنس ونقل supernatants خالية من الخلية إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب جديدة.
- للنائب في معزل عن سوبيرناتانتس الخلية الحرة، تابع إلى الخطوة 4، 2.
- تصفية بمنس بيليه (300 x ز, 5 دقيقة, 4 درجة مئوية) وريسوسبيند في 0.1 ميكرومتر "موازنة الملح" الحل (حبس) الحل هانك، التي تحتوي على عامل حفز للاختيار. للتحفيز الأمثل، واستخدام 100 ميليلتر التحفيز الحل الواحد بمنس 10 مليون لمدة 20-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في أنابيب 15 مل.
3-المجنحة في معزل عن الدم البشري
-
تجنيد متطوعين صحية لاستخراج الدم وفقا للمبادئ التوجيهية "الاتحاد الدولي للرجبى المؤسسية".
- جمع الدم من الساعد من متطوعة صحية في الأنابيب التي تحتوي على سترات الصوديوم مل 5 متوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد).
- "الماصة؛" 5 مل حل دياتريزواتي ديكستران والصوديوم (كثافة 1.113 g/mL، انظر الجدول للمواد) في أنابيب معقمة 15 مل وطبقة 5 مل دم المحيطي البشري طازجة معزولة على أعلى من ذلك ببطء.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 50 دقيقة على 400 × ز في الرايت (25 درجة مئوية) مع تسارع منخفضة ولا الفرامل.
- في نهاية الطرد المركزي، إزالة البلازما والخلايا وحيدات النوى (الطبقة العليا) باستخدام ماصة شفط بلاستيكية معقمة.
- نقل الطبقة السفلي (بمنس) في أنبوب مخروطي عقيمة 50 مل جديدة.
- إضافة وحدة تخزين تساوي 0.45% كلوريد الصوديوم إلى بمنس (المزيج جيدا و بلطف بتدوير الأنبوب).
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 400 غرام x عند 25 درجة مئوية.
-
تحلل الخلايا الحمراء
- إضافة 10 مل الماء المثلج، والعقيمة إلى خلايا الأعلاف ل 45 s متبوعاً 10 مل من المثلج العقيمة 1.8 ٪ كلوريد الصوديوم لاستعادة أوسمولاليتي.
ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات التالية لعزل المجنحة على الجليد لتجنب التنشيط المجنحة والإفراج عن النائب السابق لأوانه. خطوة تحلل نفسها النتائج في تفعيل المجنحة ضئيلة ولكن مهمة لا، ومع ذلك، من الضروري لعزل سكان المجنحة نقية لفحوصات فنية. - الطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقيقة على 250 غرام x عند 4 درجة مئوية مع تباطؤ الناعمة.
- كرر الخطوتين 3.2.1 و 3.2.2.
- ريسوسبيند بمنس في 5 مل حبس المثلج دون الكالسيوم أو المغنيسيوم. حساب مجموع الخلايا الحية (استخدام هيموسيتوميتير وجدوى تلطيخ في تمييع 1:2، انظر الجدول للمواد) قبل التحفيز.
ملاحظة: يجب استخدام بمنس معزولة للتحفيز أو تجارب أخرى ضمن ح 2 من العزلة لتجنب التغييرات الوظيفية والخلوية وموت الخلايا.
- إضافة 10 مل الماء المثلج، والعقيمة إلى خلايا الأعلاف ل 45 s متبوعاً 10 مل من المثلج العقيمة 1.8 ٪ كلوريد الصوديوم لاستعادة أوسمولاليتي.
4-النائب في معزل عن المجنحة تنشيط Supernatants
ملاحظة: يتم استخدام بروتوكول مماثل لعزل أعضاء البرلمان من بمنس مورين والبشرية.
- بمنس بيليه (300 x ز, 5 دقيقة, 4 درجة مئوية) وريسوسبيند في 0.1 ميكرومتر تصفية الحل حبس، التي تحتوي على عامل حفز لاختيار (على سبيل المثال 1 ميكرومتر فملف، انظر الحاشية: 2.3.1). التحفيز الأمثل استخدام 100 ميليلتر التحفيز الحل الواحد بمنس 10 مليون لمدة 20-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في أنابيب 15 مل.
- وتدور أسفل بمنس المنشط في 600 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية التحفيز التالي، نقل supernatants خالية من الخلية إلى أنابيب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي جديدة.
- الطرد المركزي المادة طافية مسح المجنحة في 13,000 س ز، 10 دقيقة، 4 درجة مئوية إزالة الحطام الخلية ونقل المادة المطهرة طافية في أنبوب أولتراسينتريفوجي جديدة.
- أجهزة الطرد المركزي ح 1 في 100,000 س ز، في 4 درجات مئوية. إزالة supernatants قبل تخزين MP. حسب الحاجة، مخزن القريبون من أعضاء البرلمان في البارافين مختومة أنابيب أولتراسينتريفوجي في-80 درجة مئوية حتى استخدامها في التجارب.
5-دراسة MPs المجنحة من النشاف الغربية
- إضافة المخزن المؤقت للحزب الديمقراطي الصربي 1% (50-200 ميليلتر مع الأس الهيدروجيني تريس 100 مم: 7.4) لأعضاء البرلمان بيليه (من الخطوة 4، 4)، نقل إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب جديدة، وغلى ليسيد أعضاء البرلمان لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: يجب تعديل عدد أعضاء البرلمان وحجم المخزن المؤقت لتحلل والأمثل للبروتين كل الاهتمام. -
تحميل كميات متساوية من النواب المجنحة كل حارة في تحميل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 10% β-ميركابتو-الإيثانول.
ملاحظة: مع أسلوب لدينا نحن تحميل أعضاء البرلمان التي كانت معزولة من نفس العدد من حفز بمنس.- فصل ليساتيس من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة على 10% بولياكريلاميدي هلام (استخدام V 50-100 ح 1-1.5) ونقل مجموع البروتينات على أغشية النيتروسليلوز ك وصف9.
- كتلة الأغشية ح 1 مع الحليب غير الدسم 5% في المحلول الملحي مخزنة "تريس" توين-20 0.05%، واحتضان أنه مع ابتدائية مناسبة (بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية)، تليها الثانوية الأجسام المضادة مترافق برنامج الصحة الإنجابية.
- تصور العصابات بإضافة الحل تشيمولومينيسسينسي للغشاء والتعرض الأشعة سينية فيلم داخل كاسيت واقية من الضوء (ح 1-24).
6-دراسة MPs المجنحة بالتدفق الخلوي
-
لتلوين الأجسام المضادة، تضعف الأجسام المضادة على النحو المناسب في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (برنامج تلفزيوني مع 0.1 مم يدتا، أزيد الصوديوم 0.1%). ريسوسبيند القريبون المجنحة-MPs (المستمدة من 1-3 × 106 بمنس/شرط) في 100 حل جسم ميليلتر.
- إذا تلطيخ "الخامس أنيكسين"، ريسوسبيند القريبون MPs المجنحة في المخزن المؤقت "أنيكسين الخامس" الذي يحتوي على 5 ميليلتر مترافق FITC الخامس أنيكسين. إذا شاركت تلطيخ مع الأجسام المضادة، إضافة الأجسام المضادة المطلوبة (بالنسبة مثال انظر الجدول للمواد) مباشرة إلى الحل "الخامس أنيكسين". إضافة صبغة الفلورسنت الدهن، ماليميدي N-(2-aminoethyl) (انظر الجدول للمواد)، في تركيز ميكرومتر 1 في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لتسمية وتحديد أعضاء البرلمان.
- تبني أعضاء البرلمان في تلطيخ الحل لمدة 20 دقيقة على الأقل في 4 درجات مئوية.
- أغسل أعضاء البرلمان واسطة تنبيذ فائق (ح 1 في 100,000 س ز، عند 4 درجة مئوية)؛ تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وتشغيل العينات على سيتوميتير مكان مخصص تدفق مزودة بوحدة إلكترونية محسنة لزيادة الحساسية (انظر الجدول للمواد).
7-طلبات النواب المجنحة معزولة لدراسة وظيفة المجنحة في التئام الجروح
-
في فيفو الإدارة لأعضاء البرلمان المجنحة للجروح colonic
- تخدير الفئران بحقن داخل خليط من الكيتامين (100 مغ/كغ) وإكسيلازيني (5 ملغ/كغ). تأكيد التخدير بدواسة ريفلكس (قرصه إصبع ثابتة) وضبط حسب الضرورة.
- ضع الماوس على المعدة واستخدام الملقط خزعة 28 سم والمنظار مجهزة بكاميرا عالية الدقة (مثل المنظار بيطرية لاستخدام الحيوانات الصغيرة، انظر الجدول للمواد)، تولد 3-5 إصابات سطحية بجانب الظهرية القولون. عند الانتهاء من إصابة، وضعت الفئران العودة إلى قفص على حصيرة التحكم في درجة الحرارة (37 درجة مئوية) حتى استردادها.
- تخدير الفئران (كما هو الحال في الخطوة 7-1-1). استخدام المنظار الحصول على الصور من الجروح التي يتعرض لها ح 24 (1 يوم) بعد إصابة. واسمحوا الفئران استعادة كما هو الحال في الخطوة 7.1.2.
- في نفس الوقت (24 ساعة بعد إصابة)، إدارة مورين MPs المجنحة المستمدة من 2 × 106 بمنس في 100 ميليلتر من حبس + مباشرة إلى كل موقع الجرح باستخدام نظام (استخدام إبرة ز 29) على أساس تنظير القولون microinjection9. ثلاثة أيام فيما بعد (يوم 4 بعد إصابة) تخدير الفئران (كما هو الحال في الخطوة 7.1.1) واستخدم المنظار للحصول على الصور من التئام الجروح. واسمحوا الفئران استعادة كما هو الحال في الخطوة 7.1.2.
- استخدام برنامج تحليل الصور المفضلة (انظر الجدول للمواد)، مناطق المخطط التفصيلي مرئية الجرح في الصور المكتسبة، وتدبير مجال نفس الجرح في أيام 1 و 4 بعد إصابة، وحساب النسبة المئوية لإغلاق الجرح.
-
الإنسان طلائي الخلايا في المختبر التئام
- BBe كربونات الكالسيوم-2 العد أو T84، الخلايا الظهارية المعوية البشرية التي هيموسيتوميتير والبذور 5 × 105 خلايا/بشكل جيد في لوحات الثقافة 24-جيدا. احتضان الخلايا الموجودة في غرفة حضانة قياسية في 37 درجة مئوية و 5% CO2. كربونات الكالسيوم-2 BBe أو T84 تصل إلى كونفلوينسي داخل 48 ح9. الثقافة الخلايا الظهارية، استخدم دميم ودميم-F12 (50/50) مع ملاحق كما سبق وصف9.
- توليد الجروح الصفر الميكانيكية في أحادي الطبقة باستخدام تلميح ماصة وشفط منخفضة كما هو موضح سابقا4،9. الحصول على صور مناطق الجرح فورا بعد خدش استخدام مجهر مقلوب مرحلة-على النقيض تدخل تفاضلية (استخدام 5 X أو 10 X أهداف)، لاستخدامها كوقت = النقطة المرجعية 0.
- إضافة أعضاء البرلمان (مشتقة من 2-4 × 106 بمنس) إلى مونولاييرس خدش-إصابة الخلايا الظهارية، واحتضانها لإضافية 24 ساعة (48 ساعة بعد إصابة، في 37 درجة مئوية مع 5% CO2). وفي هذا الوقت إعادة الحصول على الصور من الصفر-الجروح.
- استخدام برنامج تحليل الصور المفضلة (انظر الجدول للمواد) لقياس المجالات الجرح في t = 0 و t = 48 حاء حساب النسبة المئوية لإغلاق الجرح بواسطة تحديد الفرق في منطقة الجرح عند نقطة زمنية محددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
سيتوميتريك تحليل لتدفق التمثيلية MPs التي كانت معزولة من الإنسان والفأر بمنس مبينة في الشكل 1. يمكن تقييم تباين حجم النواب المجنحة بالمقارنة بالخرز الحجم المعروفة كما هو مبين في الشكل 1أ، ب للبشرية MPs. ملاحظة، لوحظت لا اختلافات كبيرة في حجم التباين بين الفأر والإنسان من أعضاء البرلمان. وبالمثل، استخدام التدفق الخلوي ووسم الأسفار، التعبير عن البروتين/s اختيار النواب معزولة من الماوس أو البشرية المنشأ يمكن تحديده. على سبيل المثال، يمكن أن يتم فحص التعبير عن الفوسفاتيديل سيرين (PhS) تلطيخ V أنيكسين. نخاع العظام مورين MPs المجنحة تظهر في الشكل 1،ج، د. ويمكن أيضا تقييم التعبير عن عدة علامات الاختيار كما هو موضح "أنيكسين الخامس" وتلطيخ CD11b البشرية من أعضاء البرلمان، الشكل 2أ وب. هناك طريقة أخرى للكشف عن أعضاء البرلمان المجنحة بالتدفق الخلوي وصمة عار بمنس طازجة-المعزولة قبل التحفيز كما هو مبين في الشكل 2ج. على سبيل المثال، المجنحة تلطيخ مع علامة دهن N-(2-aminoethyl) ماليميدي-فيتك قبل نتائج التحفيز فملف في الإفراج عن أعضاء البرلمان الخضراء، التي يمكن سهولة الكشف عن التدفق. من المذكرة، بينما تلطيخ مع N-(2-aminoethyl) ماليميدي-فيتك سابقا استخدمت لتسمية والكشف عن أعضاء البرلمان التي تم الحصول عليها من الدم البشري10 أو حقن الحيوانات11، استخدام علامات أخرى لتصنيف أغراض يجب أن يحدد التطبيق في المختبر أو في فيفو كل محقق. بالإضافة إلى التدفق الخلوي، يمكن تحليلها MPs المجنحة التي إيمونوبلوتينج للبروتينات للفائدة. وبحثت كما هو موضح في البرلمان الرقم 3، المستمدة من بمنس البشرية التي قد حفزت مع عدة المنشطات المعروفة، للتعبير عن مفتاح التحريضية (مصفوفة ميتالوبيبتيداسي 9 (MMP-9) وميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات)) و للالتهابات (أنيكسين A1) الجزيئات. وكما يتضح من الممثل إيمونوبلوتس، تحفيز المجنحة مع IFNγ (50 نانوغرام/مل)، سلطة النقد الفلسطينية (200 nM)، وادي فملف (1 ميكرومتر) في التعبير عن مستويات مختلفة من التمثيل التناسبي المختلط-9 من أعضاء البرلمان. ومع ذلك، اضطراب فقط من cytoskeleton أكتين لاترونكولين ب (1 ميكرومتر) قبل التحفيز مع فملف (5 ميكرون) أدت إلى وجود وفرة من الخطة الرئيسية للعمليات في البرلمان المجنحة. وبالمثل، تم الكشف عن مستويات متفاوتة من A1 أننيكسين (عالية للكشف عن لا) على أعضاء البرلمان عقب تفعيل الشروط الموصوفة. هذه النتائج تشير إلى أن تكوين المجنحة-MP تعتمد على التحفيز.
أخيرا، يظهر الشكل 4 كيف MPs المجنحة معزولة يمكن استخدامها لدراسة الجرح الشفاء في المختبر و في فيفو في الإصابات colonic. يمكن إضافة MPs المجنحة إلى جرحى الصفر مونولاييرس الظهارية في الثقافات، حيث يمكن رصد الشفاء بالتصوير اقتناء في نقاط زمنية محددة سلفا. كذلك يمكن أن تكون ميكروينجيكتيد أعضاء البرلمان مباشرة في الجروح colonic، التي تم إنشاؤها بواسطة ملقط خزعة و التصوير بالمنظار9، ويمكن تقييم أثرها على الشفاء. للتحليل في المختبر و في فيفو لالتئام الجروح، تكتسب صور جروح التي يتعرض لها فورا بعد إصابة (أو خلاف ذلك كما هو محدد) و بشكل مستمر عن طريق عملية الشفاء في نقاط زمنية محددة سلفا. استخدام برنامج تحليل الصور المتاحة تجارياً، قياس التغيرات في منطقة الجرح (الحجم) وتستخدم لتحديد سعر إغلاق الجرح. طلب من أعضاء البرلمان المجنحة التي تحتوي على الخطة الرئيسية للعمليات أما مثقف مونولاييرس الظهارية أو في فيفو للجروح colonic قد آثار ضارة، مما يؤدي إلى تأخير الشفاء9.
الشكل 1 . تحليل حجم MP المجنحة وعلامات السطحية بالتدفق الخلوي- (أ) سيتوميتير التدفق الأمثل الخرز التحكم (انظر الجدول للمواد) ذات أحجام معروفة وتظهر القيم المبعثرة في تمثيل متعامد SSC ومنتدى التعاون الأمني. الخرز وتستخدم للحصول على مقارنة حجم نسبي مع عينة المجنحة-النائب سيظهر في B (ب) البشرية المجنحة أعضاء البرلمان كانت معزولة وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي استخدام الشروط الموضحة الخرز. يمكن النظر إلى التباين في الأحجام النائب. (ج–د) النواب المستمدة من فملف-وحفز نخاع العظام مورين بمنس حللت بالتدفق الخلوي. رسومات تخطيطية لتدفق الممثل تظهر أونستينيد (ج) أو أنيكسين الخامس-فيتك الملون (د) MPs. يظهر منطقة مستطيلة Annexin الخامس-إيجابية MPs (فيتك-إيجابية MPs). التعاون بين بلدان الجنوب: الجانب مبعثر؛ منتدى التعاون الأمني: مبعثر إلى الأمام؛ PhS: الفوسفاتيديل سيرين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . تلطيخ النائب المجنحة والتحليل بالتدفق الخلوي- منطقة أونستينيد (A) والخامس-فيتك و hCD11b-آسيا والمحيط الهادئ-الملطخة MPs. ساحة أنيكسين (ب) يرفق Annexin V/CD11b سكان إيجابية مزدوجة المجنحة-MPs. (ج) عزل طازجة بمنس البشرية (1 × 106) كانت ملطخة بصبغة فلورسنت ، N-(2-aminoethyl) ماليميدي-فيتك وحفز مع فملف. أعضاء البرلمان كانت معزولة من سوبيرناتانتس الخلية وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. منطقة مستطيلة إحاطة سكان النائب إيجابي N-(2-aminoethyl) ماليميدي-فيتك (م-فيتك، تسمية محور ص). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . تكوين المجنحة-البرلمان تعتمد على التحفيز. حفز "بمنس البشري" (A) مع IFNγ، TNFα، فملف، وسلطة النقد الفلسطينية، أو مزيج من لاترانكولين ب يليه فملف (لتب-فملف). أعضاء البرلمان بمعزل عن سوبيرناتانتس الخلية الناتجة من تنبيذ فائق وقد أعدت ليساتيس البروتين في المخزن المؤقت للحزب الديمقراطي الصربي 1%. كانت مفصولة بحجم اليكتروفوريتيكالي في جل polyacrylamide 10% البروتينات وتنقل إلى غشاء النيتروسليلوز وسبر لجسم الابتدائي أما MMP-9، والخطة الرئيسية للعمليات، أو Annexin A1 متبوعاً بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة مترافق برنامج الصحة الإنجابية. (ب) "المجهر الإلكتروني تمثيلية" تصور صوراً للنواب المجنحة البشرية حجم عدم التجانس. اكسوسومي < 100 نانومتر في الحجم يشار بواسطة السهم الأبيض. شريط المقياس = 250 نيوتن متر (لوحات اليمين واليسار). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: استخدام MPs المجنحة معزولة في دراسة دور بمنس في الظهارية التئام الجروح- (أ) كربونات الكالسيوم-2 BBe الخلايا الظهارية المعوية البشرية كانت مطلية كونفلوينسي وجرحى إلى الصفر، ويتعرضون للنواب المستمدة من بمنس 3 مليون، التي أضيفت على الفور بعد إصابة. إظهار الصور التمثيلية إغلاق الجرح (48 ساعة بعد إصابة) في عنصر التحكم (يسار لوحات) والمجنحه-النائب-تعامل الخلايا الظهارية (لوحات الحق). شريط المقياس = 100 ميكرومتر-(ب) لدراسة أثر المجنحة-أعضاء البرلمان على colonic الجرح الشفاء في فيفو، تم حقن MPs المجنحة معزولة مباشرة في منطقة الجرح باستخدام نظام microinjection القائم على التنظير (في 24 ساعة بعد إصابة، الجرح colonic أوجز بخط متقطع والحقن يتم إظهار موقع إبرة بسهم أبيض). وكان إغلاق الجرح المقررة 3 أيام في وقت لاحق (4 أيام بعد إصابة) بالتصوير بالمنظار. شريط المقياس = 300 ميكرون. (ج) قد euthanized 4 أيام بعد إصابة الفئران واستخرجت مع مقص الجراح المخاطية colonic، جزءا لا يتجزأ من مجمع درجة الحرارة (O.C.T) قطع الأمثل والمجمدة بالنتروجين السائل. ميكرومتر ثمانية أقسام الجروح كانت الملون ه-كادهيرين (الأخضر) ووصمة عار النووية DAPI (أزرق) لتقييم مستوى إعادة epithelialization (لوحات العلوي)، أو DAPI (الأزرق) و Ki67 (أحمر) لتصور المجموع وتكاثر الخلايا الظهارية في على حافة الجرح (أفرقة أقل). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكولات لعزل وتوصيف المجنحة المستمدة من أعضاء البرلمان موصوفة في هذا البلاغ. ويجب مراعاة العديد من النقاط الحرجة الرئيسية لنجاح هذا الإجراء. أولاً، يجب عزل طازجة بمنس والمستخدمة في التجارب داخل ح 2 من العزلة لمنع التنشيط التلقائي وتحبب. يجب أن يتم التعامل مع جميع من بمنس خلال العزلة وحتى هذه النقطة من التحفيز على الجليد لمنع التنشيط و الإفراج عن النائب السابق لأوانه12. وثانيا، تنبيذ فائق ح 1 أو أكثر يزيد من التكوير MPs. الثالثة، لتحليل التدفق الخلوي، الصك يجب أن تكون محسوبة بشكل صحيح مع مزيج خرز الفلورسنت المحددة في الصك (نوع الخرز يتم ضبط إلى معين الصك) لتحديد أحجام النائب بشكل صحيح. على سبيل المثال، بينما مصنع واحد لتدفق سيتوميتيرس توصي باستخدام الخرز منتدى التعاون الأمني كمعلمة مرتبط بالحجم، آخرين قد تم الأمثل الخرز التعاون بين بلدان الجنوب. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون مجهزة سيتوميتير تدفق لاستخدامها لتحليل النائب مع الإلكترونيات تمت ترقيته أفضل حل البرلمان من ضجيج الخلفية.
لتحديد أعضاء البرلمان بشكل صحيح بالإضافة إلى معلمات حجم، ينصح بشدة استخدام fluorescence تلطيخ كما هو موضح في الإجراءات المذكورة أعلاه. وعلاوة على ذلك، ينبغي تصفية كافة الحلول أثناء إعداد والعزلة من خلال نظام تصفية ميكرومتر 0.1 إلى أدنى حد من إدراج جزيئات غبار أو رواسب أخرى سوف تزيد من ضجيج الخلفية أثناء اقتناء بالتدفق الخلوي. الأهم من ذلك، ينبغي النظر في ظروف التخزين من أعضاء البرلمان. يذكر أدلة على8، وملاحظاتنا الخاصة غير المنشورة، تشير إلى أن النائب التجميد يؤدي إلى تمزق الأغشية والكسر MP. وأخيراً، متفاوتة المجنحة تفعيل شروط وتوقيت قد تغيير وتحسين الغلة النائب.
وهناك بعض القيود على هذا الأسلوب. ليس من عادة نقية (~ 85 – 90%) عزل الماوس بمنس من نخاع العظام وملوثة بالخلايا المناعية الأخرى (أساسا وحيدات النوى لمفاوية) كما يحدده تحليل تدفق سيتوميتريك. وهكذا، يعزل الناتجة قد تشمل مبالغ صغيرة من النواب الصادرة عن الخلايا المناعية الأخرى. البدائل المتاحة وتشمل عزلة بمنس بالخرز المغناطيسي المتاحة تجارياً، ولكن هذا سيكون أطول وأكثر كلفة إلى حد كبير إجراء. أخيرا، دون تسمية الأسفار، بالإضافة إلى حجم المعلمات، تمايز قاطع أعضاء البرلمان من الغبار أو الجزيئات الأخرى القابلة للذوبان أو المحمولة جوا من الأحجام المماثلة التي يمكن أن تلوث العينة التحدي وعرضه للخطأ.
في المستقبل، سوف يساعد الفرز المسمى بعلامات محددة على أعضاء البرلمان المجنحة توضيح تكوين MP تحت ظروف محفزة محددة أو نماذج من المرض، ونأمل أن تسمح باستخدام أعضاء البرلمان كعلامات التشخيصية والعلاجية من الأهداف المحتملة لعلاج أمراض التهابات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد المؤلفون لا تضارب في المصالح من أي نوع تتعلق بهذه الاتصالات
Acknowledgments
ونحن ممتنون للمساعدة التقنية للدكتور سواميناثان سوشيترا الذي يدير الأساسية "شمال غرب فينبيرج مدرسة للطب التدفق الخلوي". تم توفير التمويل من خلال DK101675 (المعاهد الوطنية للصحة).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
- Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
- Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
- Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
- Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
- Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
- Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).
