Summary
새로운 프로토콜 분리 하 고 인간에서 파생 된 미의 특성 설명 및 마우스 호 중구. 이러한 프로토콜 활용 ultracentrifugation, cytometry, 기술과 immunoblotting microparticle 콘텐츠를 분석 하 고 세포질 기능에 다양 한 셀 형식에서 파생 된 미의 역할을 연구 하기 사용할 수 있습니다.
Abstract
Polymorphonuclear neutrophil 파생 미 (PMN)-MPs)는 지질 bilayer, 직경에서 50-1000 nm에서 배열 하는 크기와 구형 microvesicles. MPs는 새로 진화, 셀 통신 및 신호 기계의 중요 한 부분 이다. 그들의 크기와 그들의 자료의 성격, 때문에 최근까지 MP 존재 간과 했다. 그러나, 향상 된 기술 및 분석 방법으로 건강과 질병에 그들의 기능 지금 나오고 있다. 여기에 제시 된 프로토콜 겨냥 된다 격리 및 PMN MPs cytometry immunoblotting 여. 또한, 몇 가지 구현 예는 주어진 다. MP 격리에 대 한 이러한 프로토콜 빠르고, 낮은-비용, 고 비싼 키트를 사용 하 여 필요 하지 않습니다. 또한, 그들은 MPs 미리 MP 릴리스 이전 소스 셀 라벨 뿐 아니라 다음 격리, cytometry에 의해 시각화 및 분석을 위한 막 특정 형광 성 염료를 사용 하 여 라벨에 대 한 허용. 그러나 이러한 메서드는, PMNs MPs 및 정교한 분석 계측에 대 한 필요성의 순도 포함 하는 몇 가지 제한이 있다. 고급 흐름 cytometer 안정적으로 MPs를 분석 하 고 잡음 또는 자동 형광 거짓 긍정적인 읽기 최소화 필요 합니다. 설명된 프로토콜 격리 하 고 MP 속 정의 사용할 수 있습니다 그리고 그들의 마커 및 다른 자극 조건 하에서 구성 변화를 특징. 크기가 exosomes 대 막 입자의 내용 인지, 그리고 그들은 조직의 항상성에서 다른 역할을 수행할 여부를 조사 하기 위해 악용 될 수 있습니다. 마지막으로, 다음 격리 및 MPs, 세포질 응답에 있는 그들의 기능 및 다양 한 질병 모델 (등, PMN 관련 된 염증 성 질환, 염증 성 장 질환 등 심각한 폐 상해)의 특성화를 탐험 수 있습니다.
Introduction
최근, "미/microvesicles" 셀 cytosol 또는 원형질 막에서 발생 되 큰 과학적 관심의 신흥 데이터 직경에서 50-1000 nm에서까지 이러한 구조 생물학 정보를 전달 수 있습니다 제안 및 셀룰러 통신의 비 정식 방법으로 제공 합니다. 면역 세포 유래 MPs 및 특히 polymorphonuclear 호 중구 (PMNs)를 제작한 이들은 PMNs 호스트 방어1,2,3선 동적인 응답 및 상처 치유에 중요 한 역할을 주어 큰 관심의 4. 글, 지금까지 수많은 보고 보여주었다 PMN 의원5, 제안 하는 잠재적인 맥락, 질병-, 종 및 MPs의 기관 특정 역할의 프로-염증 성 및 안티-염증 기능.
이 통신에 설명 된 프로토콜 건강과 질병에서 MPs의 기능을 연구, 혁신, 비용 효율적이 고 융통성 있는 방법을 제공 합니다. 그들은 많은 모형 유기 체, 기관, 및 자극 조건에 적용 됩니다. 그들은 MPs의 여러 종류의 식별을 위해 허용 하 고 그들의 프로-염증 성 및 안티-염증 기능을 해결 하기 위해 나중에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 설명 여기에 상피 상처 치유 생체 외에서 vivoPMN MPs의 기능을 공부 하는 방법. 마우스 골 수 파생 PMNs는 앞에서 설명한 방법6에서 일부 수정 적응 했다의 격리에 대 한 제시 프로토콜.
또한,이 연구에서 설명 하는 프로토콜 탐지 및 PMN MPs에 두 개의 상호 보완적인 방법으로 찾을 수 있는 특정 표시의 특성화에 대 한 허용: 서쪽 오 점 그리고 cytometry 흐름. 그러나 우리는 표준 프로토콜5 를 사용 하 여 MPs의 immunoblotting 간단 하 고 신뢰할 수 있는,, 감도 교류 cytometry 악기, 그리고 향상 된 잡음 대 신호 비율의 최근 발전 지금 허용 MPs의 추가 분석을 위해이 방법을 사용 하 여 찾을. 이 연구에서 설명된 프로토콜 통합 최근 발전과 수정 원심 분리 속도 시간, 샘플 필터링 및 동결/스토리지 조건7 의 추가 포함 하 여 원래 연구 기사에서 추천 , 8, 그리고 "배경 잡음"을 줄일, PMN MPs의 검출 한계를 개선 하 고 MPs의 다른 크기를 구분 하는 방법.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물 일 북서부 IACUC에 의해 승인 되었다. 모든 실험은 모든 관련 규제 기관 지침 준수에 따라 완료 되었습니다. 인체 혈액 기부에 대 한 동의 제시 되었고 서명; 또한,이 연구에서 모든 인간의 과목 인간의 복지에 대 한 기관 및 연방 정부 지침에 따라 치료 했다.
참고: 프로토콜 단계는 다음 하위 섹션 아래에 나열 됩니다: (i) 마우스 골 수 세포 격리; (ii) PMN 격리에서 Murine 골; (iii) PMN 별개로 인간 혈액; (iv) MP 별개로 PMN Supernatants (로 Ultracentrifugation); (v) 서 부 럽;에 의해 MPs의 특성 (vi) Cytometry;에 의해 MPs의 특성 (8 세)의 응용 프로그램 격리 된 MPs 연구 상처 치유
1. 마우스 골 수 세포 격리
-
대 퇴 골과 경골 마우스 뒷 다리에서의 해 부
- 흡입 마 취에 대 한 (예를 들어, 빈 1 mL 팁 상자) 안락사 상자를 준비 합니다. 100 %isoflurane 녹화 플라스틱 상자 뚜껑의 안쪽에 메 마른 헝겊에 몇 방울을 추가 합니다. 새로운 IACUC 지침에 의하여 하지 동물 isoflurane와 직접 접촉에와 서, 따라서 마우스와는 isoflurane 포함 된 거 즈 팁 홀더를 배치 한다.
참고: Isoflurane 강력한 inhalational 마 취 이며 증기 두건 안쪽 극단주의 함께 처리 되어야 합니다. - IACUC 추천에 의하여 쥐 안락사 그것은 호흡을 정지 했다 때까지 1-5 분 1.1.1 단계에서 설명한 안락사 상자 안에 마우스를 놓습니다. 자 궁 경부 전위를 수행 하 여 동물의 죽음을 확인 합니다.
- 족집게 0.17 m m X 0.1 m m 스테인리스, 곡선, 12 cm를 사용 하 여 복 부 피부와 위와 더 낮은 사지 사이 절반 방법 피부를 잘라. 여기에서 더 낮은 말단을 포함 하 여 마우스 신체의 가장 말 초 부분에 피부 껍질. 10 cm 긴, 똑바로 해 부가 위, 뒷 다리에서 근육을 제거 하 고 대 퇴 골 머리 그대로 엉덩이 관절 탈 구.
- 가 위를 사용 하 여 대 퇴 골 및 경골 근육 해 부 및 대 퇴 골은 경골에서 분리. 뼈의 끝 그대로 그대로 골의 상당한 금액을 포함 하는 것을 확인 하십시오.
- 종이 타월 내 뼈를 압 연 하 여 모든 나머지 살을 제거 합니다. 혈 청 무료 매체 (SFM, 즉, 혈 청 또는 항생제 없이 Dulbecco의 수정 독수리의 매체 (DMEM))를 포함 하는 페 트리 접시에 깨끗 한 뼈를 놓습니다.
- 70% 에탄올에 그리고 SFM에 뼈를 씻어.
- 50 mL 원뿔 튜브에 SFM의 50 mL를 준비 합니다. 10 mL 주사기에 SFM의 10 mL를 로드 하 고 25 및 5/8 인치 계기 바늘에 첨부.
- 골 수 (붉은 색) 하 여 표시 될 때까지 위는 뼈의 끝을 잘라.
- 새로운 50 mL 튜브로 골 수 세포를 플러시. 10 mL 주사기를 사용 하 여 약 3 mL/뼈 SFM의 26, 5/8 인치 계기 바늘. 끝나면 홍 조 셀 집계를 (사용 일회용 1 mL 플라스틱 팁)를 pipetting으로 튜브에 세포를 resuspend.
- 흡입 마 취에 대 한 (예를 들어, 빈 1 mL 팁 상자) 안락사 상자를 준비 합니다. 100 %isoflurane 녹화 플라스틱 상자 뚜껑의 안쪽에 메 마른 헝겊에 몇 방울을 추가 합니다. 새로운 IACUC 지침에 의하여 하지 동물 isoflurane와 직접 접촉에와 서, 따라서 마우스와는 isoflurane 포함 된 거 즈 팁 홀더를 배치 한다.
2. PMN 격리 Murine 골 수에서
-
붉은 세포 세포의 용 해
- Centrifuging 350 x g 4 ° c.에 8 분에 의해 수집 된 골 수를 작은
- 0.2%의 20 mL에 셀 펠 릿 resuspend lyse 적혈구 분수를 약 20-30 s NaCl. 30을 초과 하지 않도록이 s PMN 세포 귀 착될 것 이다. 추가 20 mL 1.6%의 NaCl osmolality 복원 하.
참고:이 단계는 매우 작은 PMN 활성화 이어질 수 있습니다. - 씻으십시오 2 mL PBS와 2.1.1 위의 단계 에서처럼 원심 분리기의 셀. 제거는 상쾌한.
- 분리 PMNs 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 진행 합니다.
-
조밀도 기온 변화도 원심 분리에 의해 호 중구의 격리
- 따뜻한 polysucrose와 나트륨 diatrizoate 솔루션, 1.119 g/mL 및 1.077 g/mL ( 재료의 표참조), 사용 하기 전에 실내 온도 (RT)의 밀도와.
- Polysucrose와 나트륨 diatrizoate 그라디언트 신선한, 천천히 1.077 g/mL 밀도 솔루션 15 mL 원뿔 튜브에 1.119 g/mL 밀도 솔루션의 이상 3 mL의 3 mL을 레이어 링 하 여 골 수 세포 응용 프로그램 직전 준비 합니다.
참고: 사전에 너무 멀리 그라데이션 솔루션의 준비 레이어 및 가난한 호 중구 순도 복구 발생 합니다. - 얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL에 골 셀 펠 릿을 resuspend와 polysucrose와 나트륨 diatrizoate 위에 결과 세포 현 탁 액을 오버레이 그라데이션 (천천히, 레이어 혼합을 피하기 위해).
- 850 x g 브레이크 없이RT에서 25 ° c에서 30 분 동안 원심 분리기. 골 수에 있는 다른 세포는 호 중구의 효과적인 분리에 대 한 RT에는 시 약을 계속. 그라데이션 효율적으로 형성 하 고 원심 분리 단계 후에 유지 될 수 있도록 천천히 감속에 있는 원심 분리기를 설정 합니다.
- 시각적으로 단 셀 레이어를 PBS와 1.077 g/mL 밀도 솔루션 (상위 계층)의 인터페이스에서 찾습니다. PMN 밴드를 방해 하지 않고이 레이어와 밀도 솔루션의 나머지 부분을 제거 합니다.
- 15 mL 튜브 전송 피 펫을 사용 하 여 전체 PMN 레이어 및 기본 polysucrose와 나트륨 diatrizoate 1.119 g/mL 해결책의 일부를 수집 합니다.
참고: 격리 PMNs의 순도 상위 계층의 완전 한 제거에 따라 달라 집니다. - 필터링 된 PBS (0.1 µ m 기 공 크기 필터를 통해 필터링)와 4 ° c.에서 5 분, 300 x g에서 원심 분리기 튜브 탑
- 2.2.7 단계에서 원심 분리 조건을 사용 하 여 PBS의 2 mL와 수송과 PMNs 워시.
- 필터링 된 PBS의 1 mL에 resuspend 및 격리 PMNs hemocytometer 여.
참고:이 격리 방법에 대 한 결과 PMN 순도에 도달 ~ 85-90%, cytometry에 의해 평가 되었다. 분수를 오염 하는 나머지 단 세포의 주로 구성 되어 있습니다.
-
MP 출시를 유도 하기 위해 PMN 자극
참고: PMNs MPs N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-myristate-13-아세테이트 (PMA), 또는 인터페론 감마 (IFNγ)를 포함 하 여 다양 한 활성화 조건을 사용 하 여 릴리스를 자극 수 있습니다. 중요 한 것은, 시뮬레이션, 이전 PMNs 지켜져야 한다 얼음에 항상.- 펠 릿 PMNs (300 g, 5 분, 4 ° C) 및 0.1 µ m에 resuspend 포함 하는 선택의 자극 에이전트 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 솔루션, 필터링. 최적의 자극에 대 한 15 mL 튜브에 37 ° C에서 20-30 분 동안 10 백만 PMNs 당 100 µ L 자극 솔루션을 사용 합니다.
참고: 다음 활성 제 농도 성공적으로 우리의 이전 작품에 사용 되었다: fMLF (0.5-1 µ M 인간과 마우스 PMNs에 대 한 2-5 µ M에 대 한), PMA (200 nM), 및 IFNγ (100 ng/mL). 사전 분류 MPs의 릴리스를 원하는 경우 unstimulated PMNs 품 어 (1-5 10 배6) N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC와 ( 재료의 표참조) (100 µ L HBSS, 15 분, 37 ° C에서에서 1 µ M). 진행 단계 2.3.1-2.3.3. - PMNs 제거 하 고 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브 셀 무료 supernatants 전송 하 4 ° C에서 5 분 동안 850 x g에 아래로 회전 합니다.
- 셀 무료 supernatants 별개로 MP, 4.2 단계로 계속.
- 펠 릿 PMNs (300 g, 5 분, 4 ° C) 및 0.1 µ m에 resuspend 포함 하는 선택의 자극 에이전트 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 솔루션, 필터링. 최적의 자극에 대 한 15 mL 튜브에 37 ° C에서 20-30 분 동안 10 백만 PMNs 당 100 µ L 자극 솔루션을 사용 합니다.
3. 인간의 혈액에서 PMN 격리
-
기관 IRB 지침에 따라 혈액 추출에 대 한 건강 한 자원 봉사자를 모집 합니다.
- 상용 5 mL 나트륨 시트르산 포함 된 튜브 ( 재료의 표참조)로 건강 한 자원 봉사자의 팔 뚝에서 피를 수집 합니다.
- Dextran 및 나트륨 diatrizoate 솔루션의 5 mL를 플라스틱 (1.113 g/mL의 조밀도 재료의 표참조) 살 균 15 mL 튜브와 천천히 레이어 위에 갓 고립 된 인간 주변 혈액 5 mL로.
- 50 분 낮은 가속 RT (25 ° C)에서 g x 400와 아무 브레이크 튜브 원심
- 원심 분리의 끝에, 플라스마와 단 세포 (상위 계층) 살 균 플라스틱 흡입 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다.
- 레이어 (PMNs) 새로운 살 균 50 mL 원뿔 튜브로 전송 합니다.
- 0.45%의 동일한 볼륨 추가 NaCl PMNs (믹스 잘 부드럽게 튜브를 회전 하 여)을.
- 25 ° c.에 400 x g에서 10 분 원심 분리기
-
붉은 세포 세포의 용 해
- 45 수송과 셀에 얼음 처럼 차가운, 살 균 물 10 mL를 추가 s 뒤에 10 mL의 얼음 처럼 차가운 살 균 1.8% NaCl osmolality 복원 하.
참고: PMN 격리에 대 한 모든 다음 단계 PMN 활성화 및 조기 MP 출시 방지 하기 위해 얼음에 수행 되어야 한다. 그러나 자체 세포 단계 결과 사소한 그러나 중요 하지 PMN 활성화에,, 그것은 기능 분석에 대 한 순수한 PMN 인구를 분리 하는 데 필수적입니다. - 부드러운 감속으로 4 ° C에서 250 x g에서 10 분 동안 셀 원심
- 3.2.1, 3.2.2 단계를 반복 합니다.
- 얼음 처럼 차가운 HBSS 칼슘 또는 마그네슘의 5 ml에서 PMNs resuspend. 총 라이브 셀 (hemocytometer와 생존 1:2 희석에 얼룩을 사용 하 여 테이블의 자료를 참조 하십시오) 자극 하기 전에.
참고: 격리 PMNs 수 사용 해야 자극 또는 절연의 2 h 이내 다른 실험에 대 한 변경 기능 및 세포와 세포 죽음을 피하기 위해 합니다.
- 45 수송과 셀에 얼음 처럼 차가운, 살 균 물 10 mL를 추가 s 뒤에 10 mL의 얼음 처럼 차가운 살 균 1.8% NaCl osmolality 복원 하.
4. MP 격리 활성화 PMN Supernatants에서
참고: 비슷한 프로토콜 murine 인간과 PMNs에서 MPs의 절연을 위해 사용 됩니다.
- 펠 릿 PMNs (300 g, 5 분, 4 ° C) 및 0.1 µ m에 resuspend 필터링 HBSS 솔루션을 포함 하는 선택의 자극 에이전트 (예 1 µ M fMLF 참조 참고: 2.3.1). 최적의 자극에 대 한 15 mL 튜브에 37 ° C에서 20-30 분 동안 10 백만 PMNs 당 100 µ L 자극 솔루션을 사용 합니다.
- 다음 자극, 활성화 PMNs 600 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 아래로 회전 하 고 새로운 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 무료 supernatants 전송.
- PMN 허가 상쾌한 13000 x g, 10 분, 세포 파편을 제거 하 고 새로운 ultracentrifuge 관으로 지운된 상쾌한 전송 하 4 ° C에서 원심
- 4 ° c.에 100000 x g에서 1 시간을 위한 원심 분리기 Supernatants MP 저장 하기 전에 제거 합니다. 필요에 따라 저장소 수송과 MPs 파라핀 실험에서 사용까지-80 ° C에서 ultracentrifuge 관 봉인에.
5. 서양 Blotting에 의해 PMN MPs의 검사
- 1 %SDS 버퍼 추가 (50-200 µ L 100 mM Tris ph: 7.4) MPs를 펠 렛 (4.4 단계)에서 전송 새로운 1.5 mL microcentrifuge 관에 고 5 분 동안 lysed MPs를 삶아.
참고: 수 MPs와 세포의 용 해 버퍼 볼륨 조정 고 관심사의 각 단백질에 대 한 최적화 될 해야 합니다. -
Β-mercapto-에탄올 10%를 포함 하는 버퍼를 로드 레인 당 같은 양의 PMN MPs를 로드 합니다.
참고: 우리의 방법으로 우리 자극된 PMNs의 동일한 수에서 고립 되었다 MPs 로드 합니다.- 10 %polyacrylamide 젤에 SDS 페이지 lysates 분리 (50-100 V을 사용 하 여 1-1.5 h에 대 한) 니트로 막에 총 단백질 설명된9로 전송.
- 막 5% 비-지방 우유 0.05% 트윈 20 Tris 버퍼 염 분에서 1 시간에 대 한 차단 하 고 뒤에 보조 HRP 활용 된 항 체 (하룻밤에 4 ° C), 적절 한 기본으로 품 어.
- 막 하는 광선이 카세트 (1-24 h) 내부는 x 선 필름에 노출 chemoluminescence 솔루션을 추가 하 여 밴드를 시각화 합니다.
6. Cytometry에 의해 PMN MPs의 검사
-
항 체 얼룩이 지기 위해 FACS 버퍼 (PBS 0.1 m m EDTA, 0.1% 나트륨 아 지 드)에 적절 하 게 항 체 희석. Resuspend 수송과 PMN MPs (10 x 1-3에서 파생 된6 PMNs/조건) 100 µ L 항 체 솔루션에서.
- Annexin V에 대 한 얼룩, FITC 활용 Annexin V의 5 µ L를 들어 Annexin V 버퍼에 수송과 PMN MPs를 resuspend. 공동 항 체와 얼룩, Annexin V 솔루션에 직접 원하는 항 체 (대 한 예에서는 참조 테이블의 재료)를 추가 합니다. 추가 지질 형광 염료, N-(2-aminoethyl) maleimide ( 재료의 표참조), 레이블 및 MPs 식별 하 FACS 버퍼의 100 µ L에 1 μ M 농도에서.
- 4 ° c.에 20 분 이상 솔루션 얼룩에 MPs를 품 어
- Ultracentrifugation (4 ° C에서 100000 x g에서 1 h);에 의해 MPs를 씻어 폐기는 상쾌한.
- FACS 버퍼에 resuspend 및 증가 한 감도 위해 업그레이드 된 전자 장치를 갖춘 지정 된 교류 cytometer에서 샘플을 실행 ( 재료의 표참조).
7. 상처 치유에 PMN 함수 공부 절연된 PMN MPs에 대 한 응용 프로그램
-
Vivo에서 관리 PMN MPs의 저 승 상처
- 케 타 민 (100mg/kg) 및 xylazine (5 mg/kg)의 혼합물의 복 주사 하 여 쥐를 anesthetize. 페달 반사 (회사 발가락 핀치)에 의해 마 취를 확인 하 고 필요한 조정.
- 그것의 위에에 28 cm 생 겸 고해상도 카메라가 장착 된 내 시경을 사용 하 여 마우스를 두고 (작은 동물 사용에 대 한 수의 내 시경 같은 재료의 표참조), 생성의 등 쪽 측에 따라서 3-5 표면 상처는 콜론입니다. 완료 되 면 부상, 반환 쥐 감 금 소에 복구 될 때까지 온도 제어 (37 ° C) 매트에 배치.
- (단계 7.1.1) 에서처럼 마우스 anesthetize 내 시경을 사용 하 여 해 상처 후 24 시간 (1 일) 부상의 이미지. 마우스 단계 7.1.2로 복구 하자.
- (24 시간 후 부상) 동시에 murine PMN MPs에9시경 기반 microinjection 시스템 (29 G 바늘 사용) 사용 하 여 각 상처 사이트에 HBSS + 직접 100 µ L에서 2 x 106 PMNs에서 파생 된 관리. 3 일 (7.1.1 단계)로 마우스를 anesthetize 하 고 내 시경을 사용 하 여 상처 치유의 이미지를 다시 가져오는 나중 (4 일 후 부상). 마우스 단계 7.1.2로 복구 하자.
- 선호 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 인수 이미지, 측정 같은 영역 일 1과 4 후 부상, 상처와 상처 폐쇄의 비율을 계산에서 (참조 테이블의 자료), 개요 보이는 상처 영역.
-
인간 상피 세포 생체 외에서 상처 치유
- 수 Caco-2 BBe 또는 T84, hemocytometer 씨앗 5 x 105 셀/잘 24-잘 문화 접시에 의해 인간 장 상피 세포. 37 ° C, 5% CO2표준 보육 챔버에 세포를 품 어. Caco-2 BBe 또는 T84 48 h9에서 confluency 도달. 상피 세포 문화, 이전 DMEM과 DMEM-F12 (50: 50) 보조 제와 함께 사용 설명9.
- 앞에서 설명한4,9피 펫 팁 및 낮은 흡입을 사용 하 여 단층에 기계적 스크래치 상처를 생성 합니다. 시간으로 사용 되는 반전된 단계 대조 미분 간섭 현미경 (사용 5 배 또는 10 배 목표)를 사용 하 여 긁 직후 상처 영역에의 이미지를 수집 = 0 참조 포인트.
- 긁힌 상처 상피 세포 monolayers를 MPs (2-4 X 106 PMNs에서에서 파생 됨)을 추가 하 고 추가 24 h (48 h 후 부상, 5% CO2와 37 ° C에서)에 대 한 품 어. 이 이번에 다시 처음 상처의 이미지를 취득 합니다.
- 선호 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) t 상처 영역 측정 하 = 0, t 선택한 시간 지점에서 상처 영역에서 차이 확인 하 여 48 h. 계산 상처 폐쇄의 비율 =.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
인간 으로부터 격리 되었고 PMNs 마우스 MPs의 대표적인 흐름 cytometric 분석은 그림 1에 표시 됩니다. PMN MPs의 크기가 비교 하 여 그림 1A, B와 같이 알려진된 크기의 구슬에 인간의 MPs. 참고에 대 한 평가 될 수 있다,이 질 크기에에서 상당한 차이가 마우스 및 인간의 MPs 사이 관찰 되었다. 마찬가지로, cytometry 및 형광 라벨을 사용 하 여, 단백질/s 마우스 또는 인간 근원의 고립 된 MPs에 의해 선택의의 식이 확인할 수 있습니다. 예를 들어 Phosphatidyl 떠들고 (PhS)의 표현 시험 될 수 있다 Annexin V 얼룩에 의해. Murine 골 PMN MPs 그림 1C, D에표시 됩니다. 선택의 여러 마커의 식 Annexin V 및 CD11b 인간의 MPs, 그림 2A, B의얼룩 같이 또한 평가 수 있습니다. Cytometry에 의해 PMN MPs를 감지 하는 또 다른 방법은 그림 2C자극 전에 갓 절연 PMNs 얼룩입니다. 예를 들어 PMN fMLF 자극 결과 녹색 MPs의 출시에 앞서 지질 표시 N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC와 함께 얼룩을 감지할 수 있습니다 쉽게 흐름에 의해. 노트, N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC와 착 색 하는 동안은 이전에 사용 된 레이블 및 주변 인간의 피10 에서 얻은 되거나 동물11, 목적을 위해 라벨에 대 한 다른 마커를 사용 하 여 주입 된 MPs를 감지 하 생체 외에서 또는 vivo에서 응용 프로그램은 각 조사에 의해 결정 되어야 합니다. Cytometry, 뿐만 아니라 PMN MPs immunoblotting 관심사의 단백질에 의해 분석할 수 있습니다. 몇 가지 알려진된 활성으로 자극 했다 인간의 PMNs에서 파생 하는 그림 3, MPs 같이 키 염증 성 표현에 대 한 조사 됐다 (매트릭스 metallopeptidase 9 (MMP-9) 및 myeloperoxidase (MPO))과 항 염증 제 (Annexin a 1) 분자입니다. 대표 immunoblots, IFNγ와 PMN 자극에서에서 분명 (50 ng/mL), PMA (200 nM), MPs MMP 9의 다양 한 수준의 표현 결과 fMLF (1 µ M). 그러나, Latrunculin B (1 µ M) 이전 fMLF (5 µ M)과 자극에 의해 말라 골격의 유일한 섭 동 PMN MPs에서 MPO의 풍부한 존재를 이끌었다. 마찬가지로, Annexin a 1 (높은 감지 되지 않습니다)의 다양 한 수준의 설명된 활성화 조건 다음 MPs에 발견 했다. 이 결과 제안 PMN MP 구성은 자극에 따라 다릅니다.
마지막으로, 그림 4 쇼 절연된 PMN MPs 공부 하는 데 사용할 수 있습니다 어떻게 상처 치유 생체 외에서 그리고 vivo에서 장 부상에. PMN MPs 문화, 어디 치유 수 모니터링할 이미징 미리 정해진된 시간 지점에서 인수 하 여 상피 monolayers 스크래치 상처에 추가할 수 있습니다. MPs는 생 검 겸 자 및 내 시경 이미징9에의해 생성 된 저 승 상처에 직접 microinjected 더 수 고 치유에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. 상처 치유의 체 외에서 그리고 vivo에서 모두 분석 해 상처의 이미지 인수 즉시 게시물 부상 (또는 지정 된 기타)와 미리 정해진된 시간 지점에서 치유 과정을 통해 지속적으로. 상업적으로 사용 가능한 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여, 상처 면적 (크기)에 변화 측정 되며 상처 폐쇄 속도 결정 하는 데 사용. 원의 PMN-MPO를 포함 하는 응용 프로그램 배양 상피 monolayers 또는 vivo에서 저 승 상처 지연된 치유9로 이어지는 해로운 효과 있다.
그림 1 . PMN MP 크기와 cytometry에 의해 표면 마커 분석. (A) 교류 cytometer는 알려진된 크기의 제어 구슬 ( 재료의 표참조)를 최적화 하 고 분산형 값 SSC와 FSC 직교 표현에 표시 됩니다. 구슬 B. 에서처럼 PMN MP 샘플 상대 크기 비교를 가져오는 데 사용 됩니다 (B) 인간 PMN MPs 고립 되었고 cytometry 구슬에 대 한 설명 하는 조건을 사용 하 여 분석. MP 크기에이 볼 수 있습니다. (C-D) Murine 골 fMLF 자극 PMNs에서 파생 된 MPs는 cytometry에 의해 분석 되었다. 대표 흐름도 흠 없는 (C) 또는 Annexin V FITC 스테인드 (D) MPs. 사각형 영역 표시 Annexin V-긍정적인 MPs (FITC 긍정적인 MPs)를 표시 합니다. SSC: 사이드 분산형; FSC: 앞으로 분산형; PhS: Phosphatidyl 떠들고입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . PMN MP 얼룩이 지 고 분석 cytometry. (A) Unstained (B) Annexin V FITC-및 hCD11b-APC-스테인드 MPs. 광장 지역 포함 PMN의 Annexin V/CD11b 두 배 긍정적인 인구-MPs. (C) 갓 고립 된 인간의 PMNs (1 x 106) 형광 염료와 스테인드 했다 N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC fMLF를 자극. MPs 셀 supernatants 으로부터 격리 되었고, cytometry에 의해 분석. 사각형 영역 N-(2-aminoethyl) maleimide FITC 긍정적인 MP 인구 (M-FITC, y 축 레이블)을 포함합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . PMN MPs의 구성은 자극에 따라 다릅니다. (A) 인간의 PMNs IFNγ, TNFα, fMLF, PMA, 또는 latranculin fMLF (LtB fMLF) 다음 B의 조합으로 자극 했다. MPs ultracentrifugation에 의해 결과 셀 supernatants 으로부터 격리 되었고 단백질 lysates 1 %SDS 버퍼에 준비 했다. 단백질 10 %polyacrylamide 젤에 electrophoretically 크기 구분, 니트로 막 전송 되었고 MMP 9, MPO, 또는 Annexin a 1 주 항 체 뒤에 해당 HRP 활용 된 이차 항 체에 대 한 조사. (B) 대표 전자 현미경 인간의 PMN MPs의 이미지 묘사이 크기. exosome < 100 nm 크기에서 흰색 화살표로 표시 됩니다. 눈금 막대 = 250 nm (왼쪽 및 오른쪽 패널). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 상피에 PMNs의 역할을 공부 하 고 격리 된 PMN MPs를 사용 하 여 상처 치유. (A) Caco-2 BBe 인간 장 상피 세포는 confluency, 처음 부상 및 부상 후 즉시 추가 된 3 백만 PMNs에서 파생 된 MPs 복종을 도금 했다. 대표 이미지 컨트롤 (왼쪽된 패널) 및 PMN MP 취급 상피 세포 (오른쪽 패널) 상처 폐쇄 (48 h 후 부상)을 표시합니다. 눈금 막대 = 100 µ m. 저 승에 PMN MPs의 효과 검사 (B) 상처 치유 vivo에서, 고립 된 PMN MPs microinjection 내 시경 기반 시스템을 사용 하 여 상처 영역에 직접 주입 했다 (24 h 이후 부상, 저 승 상처는 제시 된 파선 및 주사 바늘 사이트 흰색 화살표에 의해 표시 됩니다). 상처 폐쇄 내 시경 영상 평가 3 일 후 (4 일 후 부상) 했다. 눈금 막대 = 300 µ m. (C) 4 일 후 쥐 부상 했다 안락사와 저 승 점 막 상처가 위 추출, 최적의 절삭 온도 (O.C.T) 화합물에 포함 되었고 액체 질소로 냉동. 다시 epithelialization (위 패널)의 수준을 평가 하기 위해 E-cadherin (녹색) 및 핵 얼룩 DAPI (블루) 또는 DAPI (파란색)와 Ki67 (빨간색)에 총 및 확산의 상피 세포를 시각화에 대 한 상처의 8 개 마이크로미터 단면도 스테인드 했다 상처 가장자리 (낮은 패널)입니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 통신 프로토콜 격리 및 PMN 파생 된 MPs의 특성화에 대 한 설명 합니다. 몇 가지 중요 한 요점 절차의 성공에 대 한 계정에 촬영 해야 합니다. 첫째, PMNs 신선한 격리 하 고 자발적인 활성화와 degranulation 방지 하기 위해 절연의 2 h 이내 실험에 사용 될 해야 합니다. 격리 하는 동안 및 자극의 지점 PMNs의 모든 처리 활성화와 조기 MP 릴리스12방지 하기 위해 얼음에 수행 되어야 합니다. 둘째, 1 시간 이상 ultracentrifugation 극대화 cytometry 분석에 대 한 MPs. 셋째, 판, 악기는 제대로 악기 지정 형광 구슬 (구슬 종류 조정 됩니다 특정의 혼합으로 보정 해야 합니다. 악기) 올바르게 MP 크기를 정의 합니다. 예를 들어 제조 교류 cytometers는 FSC 구슬 크기 관련 매개 변수로 사용 하 여, 권장 하는 동안 다른 SSC 구슬에 대 한 최적화 되었습니다 했습니다. 또한, MP 분석에 사용할 교류 cytometer 해야 합니다 장착 업그레이드 된 전자 최고의 배경 잡음에서 MPs를 해결 하려면.
크기 매개 변수 외에 MPs를 제대로 식별 하려면 위의 절차에 설명 된 대로 얼룩 형광의 사용이 좋습니다. 또한, 준비 및 격리 하는 동안 모든 솔루션 포함 먼지 또는 다른 침전 물 중 배경 잡음을 증가 최소화 하기 위해 0.1 µ m 필터 시스템을 통해 cytometry에 의해 필터링 해야 합니다. 중요 한 것은, MPs의 보관 조건 고려 되어야 한다. 작은 증거8, 그리고 우리 자신의 되지 않은 관찰, MP 동결 막 파열과 MP 파손에 이르게 하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 다양 한 PMN 활성화 조건 및 타이밍 변경 될 수 있습니다 고 MP 수율을 향상 시킵니다.
이 방법에는 몇 가지 제한이 있습니다. 마우스 PMNs 골 수에서 절연은 일반적으로 순수 (~ 85-90%) 하 고 흐름 cytometric 분석에 의해 결정은 다른 면역 세포 (주로 단 세포)에 의해 오염 된. 따라서, 결과 격리 MPs 다른 면역 세포에 의해 발표의 작은 금액을 포함할 수 있습니다. 그러나 대안 사용할 수 있으며 상업적으로 이용 가능한 자석 구슬 PMNs의 격리를 포함,이 길고 크게 costlier 절차. 마지막으로, 크기 매개 변수 외에 형광 라벨 없이 먼지에서 MPs의 확실 한 차별화 또는 샘플을 오염 시킬 수 있는 비슷한 크기의 다른 성 또는 공 수 입자 이며 도전 오류가.
미래에, PMN MPs 특정 마커 표시의 정렬 도움이 됩니다 MP 구성 물질로 특정 조건 또는 질병의 모델을 명료 하 고 잘하면 MPs의 사용에 대 한 진단 마커 및 잠재적인 치료 표적으로 치료 하 염증 성 질환입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는이 통신에 관련 된 어떤 종류의 충돌의 관심을가지고
Acknowledgments
우리는 북서부 Feinberg 학교의 의학 교류 Cytometry 코어를 실행 하는 박사 Suchitra Swaminathan의 기술 지원에 대 한 감사입니다. 자금 (NIH) DK101675에 의해 제공 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
- Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
- Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
- Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
- Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
- Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
- Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).
