פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים
Summary
זה פרוטוקול בידוד של איון תיאר תוואי הרומן של הזרקה הקולגן כדי לעכל את רקמת אקסוקרינית הליך מעבר הדרגתי פשוטה כדי לטהר את איונים מעכברים. זה כרוך בעיכול אנזימטי, הפרדת הדרגתי/טיהור, ואיסוף ביד איון. בידוד מוצלח יכול להניב 250 – 350 באיכות גבוהה, באופן מלא של איונים לכל עכבר.
Abstract
איולי הלבלב, הנקרא גם איי לנגרהנס, הם אשכול של תאים אנדוקריניים המייצרת הורמונים עבור רגולציה של גלוקוז ופונקציות ביולוגיות חשובות אחרות. איונים בעיקר מורכב מחמישה סוגים של הורמון הפרשת תאים: α תאים להפריש glucagon, תאים β להפריש אינסולין, δ תאים להפריש סוסטטין, ε תאים להפריש ghrelin, ו PP תאים להפריש polypeptide הלבלב. 60 עד 80% התאים באיים הם β תאים, שהם אוכלוסיית התאים החשובים ביותר ללמוד הפרשת אינסולין. איי הלבלב הם מערכת מודל חיונית כדי ללמוד לשעבר הפרשת אינסולין vivo. הקניית איים באיכות גבוהה היא בעלת חשיבות רבה לחקר הסוכרת. רוב הליכי בידוד של איון דורשים מבחינה טכנית קשה לגשת לאתר של הזרקת קולגן, הליכי עיכול קשים ומורכבים, ושלבי הדרגתי דחיסות מרובים. נייר זה כולל פשוט תשואה גבוהה העכבר איון בידוד שיטה עם תיאורים מפורטים והפגנות מציאותי, מראה את הצעדים הבאים ספציפיים: 1) הזרקה של הקולגן בתוך ampulla של vater, אזור קטן הצטרפות תעלת הלבלב ו צינור המרה המשותף, 2) העיכול אנזימטי והפרדה מכנית של הלבלב אקסוקרינית ו 3) צעד אחד טיהור הדרגתי. היתרונות של שיטה זו הם הזרקה של אנזים העיכול באמצעות ampulla נגיש יותר של Vater, העיכול מלאה יותר באמצעות שילוב של גישות אנזימטיות ומכני, ופשוט צעד טיהור יחיד הדרגתי. פרוטוקול זה מייצר כ-250-350 איים לכל עכבר; ו איונים מתאימים למחקרים שונים vivo ex. האזהרות האפשריות של הליך זה עלולות להינזק איונים בגלל עיכול אנזימטי ו/או דגירה ממושכת של הדרגתי, אשר כולם יכולים להימנע במידה רבה על ידי הצדקת מודעות לזמן הדגירה.
Introduction
ישנן שתי שיטות נפוצות בספרות עבור בידוד איון הלבלב. האדם דורש לנצל את הלבלב ולהכניס אותו לחתיכות קטנות באמצעות מספריים כירורגיים, ולאחר מכן לעכל אותו בתמיסה הקולגן1,2,3. עוד שיטה מדויקת יותר היא להשתמש ברשת של צינורות הנמצאים בלבלב כדי להחדיר אנזים העיכול. האתרים הבאים שימשו עבור הזרקת אנזים העיכול: הצומת של צינור המרה פיברוזיס, המרה לתוך צינור המרה המשותף, או צינור מרה משותף עצמו1,4,5. ידוע כי איונים אינם מופצים באופן שווה בלבלב; אזור הטחול מכיל את מרבית האיים6. בעוד השיטה השנייה באמצעות נתיבי אנטומי לספק אנזימי העיכול מאפשר להשלים מלאה יותר של הלבלב, כולל האזור הטחול, הליך זה דורש לעתים קרובות לולאה או מעבר ampulla של Vater כי הוא מבחינה טכנית מאתגר. מבחינת הטיהור של איון, מעברי צפיפות מרובים, כמו גם שפכים סלולריים והנסיגה המגנטית שימשו כדי לטהר את איונים3,7. הניצול של מעברי הצבע האלה יכול לגזול זמן ומעברי הצבע של פיקדול עלולים לגרום לנזק רעיל של איונים8.
הפרוטוקול הנוכחי בנוי על השיטה המתוארת על ידי Li et al.7, עם שינויים נוספים שנוספו על בסיס החוויה של עצמנו ואחרים1,4. הצעדים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול שלנו הם לסדר את צינור המרה המשותף ליד סוף הכבד, הזרקת הקוליואז P דרך ampulla של Vater לעכל את רקמת אקסוקרינית, ולאחר מכן באמצעות אמבט מים לרעוד כדי לזרז את העיכול מכנית1, 4,7. לאחר מכן, הפתרון ‘ STOP ‘ מיושם על מנת לעכב את העיכול של איונים; HBSS משמש כדי לשטוף את שאר הקולגן בתמיסה ו STOP פתרון. כאשר שימש השיטה לטיהור האיים האנושיים, התשואה דווחה כפליים מהאיונים בעלי יכולת תפקודית גדולה יותר (למשל, הפרשת אינסולין) לעומת השימוש במעברי הצבע של חלחול9. עם זאת, מחקרים חקרו את השימוש בהדרגה בעקבות ההשפעה הרעילה שלה על איונים1,10. זה דווח כי הדרגתי Histopaque מספק קינטיקה טיהור אופטימלי עבור בידוד איון העכבר, אשר מייצרת תשואה טובה של איונים באיכות גבוהה עם צעדים פשוטים יותר ועלות נמוכה1. בפרוטוקול שלנו, Histopaque-1077 משמש לטיהור איונים משאר רקמות שיורית8,11. איונים שנקטפו יכול להיות תרבותי בRPMI מלאה-1640 מדיה, או מנוצל ישירות ב-RNA/חלבון כימות.
הפרוטוקול שלנו, באמצעות שילוב של העיכול הקולגן P וצעד טיהור יחיד מעבר צבע, הוא פשוט יותר מאשר פרוטוקולים שפורסמו אחרים. השיטה שלנו לא דורשת הליכים כירורגיים תובעניים ויש לו רק כמה צעדים פשוטים. חשוב מכך, פרוטוקול זה מייצר בעקביות תשואה טובה של איונים פונקציונליים באיכות גבוהה (250-350/עכבר) כפי שדווחו12.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה כולל קולגן הפרזיה ועיכול, ואחריו טיהור של איונים. הצעדים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה הם הזרקה יעילה זלוף השלם של הלבלב1,4,7. שיטת המסירה של פרוטוקול זה מאפשרת לאנזים לחצות את המסלולים האנטומיים כדי לעכל טוב יותר את רקמת אקסוקר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו אסירי תודה לגברת ג’ניפר Munguia להמחשה האמנותית של התרשים הסכימטי. אנו מודים למר מייקל ר. הוניג בתחנת הרדיו הציבורית של יוסטון, KPFT לקבלת סיוע מערכתי. מחקר זה נתמך על ידי האגודה האמריקנית לסוכרת #1 -15-BS-177 (YS), ו-NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). עבודה זו נתמכת גם על ידי המכון הלאומי של משרד החקלאות של מזון וחקלאות, הצוהר פרויקט 1010840 (YS) ו R01 DK095118 (SG).
Materials
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- O’Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).
- Wang, X. Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas – Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes. PLOS ONE. 8, (2013).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).
- Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374 (1987).
- Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
- Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans. Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).
- Pradhan, G., et al. Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R. Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).
- Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion–a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).
