Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones
Summary
Este protocolo de aislamiento de islotes describió una novedosa vía de inyección de colagenasa para digerir el tejido exocrina y un procedimiento de gradiente simplificado para purificar los islotes de ratones. Implica digestión enzimática, separación/purificación de gradientes y selección manual de islos. El aislamiento exitoso puede producir entre 250 y 350 islotes de alta calidad y completamente funcionales por ratón.
Abstract
Los islotes pancreáticos, también llamados islotes de Langerhans, son un grupo de células endocrinas que produce hormonas para la regulación de la glucosa y otras funciones biológicas importantes. Los islotes consisten principalmente en cinco tipos de células que secretan hormonas: las células secretan el glucagón, las células secretan insulina, las células secretan somatostatina, las células secretan la ghrelina y las células PP secretan polipéptido pancreático. Sesenta al 80% de las células de los islotes son células, que son la población celular más importante para estudiar la secreción de insulina. Los islotes pancreáticos son un sistema modelo crucial para estudiar la secreción de insulina ex vivo. Adquirir islotes de alta calidad es de gran importancia para la investigación de la diabetes. La mayoría de los procedimientos de aislamiento de islos requieren un sitio de inyección de colagenasa técnicamente difícil, procedimientos de digestión agresivos y complejos y pasos de purificación de gradiente de densidad múltiple. Este papel cuenta con un sencillo método de aislamiento de islotes de ratón de alto rendimiento con descripciones detalladas y demostraciones realistas, que muestra los siguientes pasos específicos: 1) inyección de colagenasa P en la ampolla de Vater, un área pequeña que une el conducto pancreático y el conducto biliar común, 2) la digestión enzimática y la separación mecánica del páncreas exocrino, y 3) un único paso de purificación de gradiente. Las ventajas de este método son la inyección de enzima digestiva utilizando la ampolla más accesible de Vater, una digestión más completa utilizando una combinación de enfoques enzimáticos y mecánicos, y un paso de purificación de un solo gradiente más simple. Este protocolo produce aproximadamente 250—350 islotes por ratón; e islotes son adecuados para varios estudios ex vivo. Las posibles advertencias de este procedimiento son islotes potencialmente dañados debido a la digestión enzimática y/ o incubación prolongada de gradiente, todo lo cual puede evitarse en gran medida mediante una cuidadosa justificación ad del tiempo de incubación.
Introduction
Hay dos métodos comunes en la literatura para el aislamiento de islotes pancreáticos. Se requiere extirpar el páncreas y picarlo en trozos pequeños usando tijeras quirúrgicas, y luego digerirlo en una solución de colagenasa1,2,3. Otro método más preciso es utilizar la red de conductos presentes en el páncreas para introducir enzima digestiva. Los siguientes sitios se han utilizado para la inyección de enzimas digestivas: la unión de la bilis y el conducto quístico, la vesícula biliar en el conducto biliar común o el propio conducto biliar común1,4,5. Se sabe que los islotes no se distribuyen uniformemente en el páncreas; la región esplénica contiene la mayoría de los islotes6. Mientras que el segundo método que utiliza vías anatómicas para entregar enzimas digestivas permite una perfusión más completa del páncreas, incluyendo la región esplénica, este procedimiento a menudo requiere la sujeción o sutura de la ampolla de Vater que es técnicamente Desafiante. En términos de purificación de islotes, se han utilizado gradientes de densidad múltiple, así como coladores celulares y retracción magnética para purificar los islotes3,7. La utilización de estos gradientes puede llevar mucho tiempo y losgradientes de Ficoll pueden resultar en daños tóxicos de los islotes 8.
El protocolo actual se basa en el método descrito por Li et al.7, con modificaciones adicionales añadidas basadas en la experiencia de nosotros mismos y otros1,4. Los pasos más críticos de nuestro protocolo son la sujeción del conducto biliar común cerca del extremo del hígado, la inyección de colagenasa P a través de la ampolla de Vater para digerir el tejido exocrina, y luego el uso de un baño de agua agitada para acelerar la digestión mecánicamente1, 4,7. Posteriormente, se aplica una solución ‘STOP’ para inhibir la digestión posterior de los islotes; HBSS se utiliza para lavar la solución restante de colagenasa P y STOP. Cuando se utilizó el método Ficoll para purificar los islotes humanos, se informó que el rendimiento era el doble de los islotes con mayor capacidad funcional (por ejemplo, secreción de insulina) en comparación con el uso de gradientes de Percoll9. Sin embargo, los estudios han cuestionado el usodel gradiente de Ficoll debido a su efecto tóxico en los islotes 1,10. Se ha informado que el gradiente Histopaque proporciona una cinética de purificación óptima para el aislamiento de islotes de ratón, lo que produce un buen rendimiento de islotes de alta calidad con pasos más simples y menor costo1. En nuestro protocolo, Histopaque-1077 se utiliza parapurificar islotes de otros tejidos residuales 8,11. Los islotes cosechados pueden ser cultivados en medios RPMI-1640 completos, o utilizados directamente en la cuantificación de ARN/proteína.
Nuestro protocolo, utilizando una combinación de digestión de colagenasa P y un solo paso de purificación de gradiente, es más simple que otros protocolos publicados. Nuestro método no requiere procedimientos quirúrgicos exigentes y tiene sólo unos sencillos pasos. Más importante aún, este protocolo produce consistentemente un buen rendimiento de islotes funcionales de alta calidad (250-350/ratón) como informamos12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo incluye perfusión y digestión de la colagenasa, seguida de la purificación de los islotes. Los pasos más críticos de este protocolo son la inyección efectiva y la perfusión completa del páncreas1,4,7. El método de administración de este protocolo permite a la enzima atravesar las rutas anatómicas para digerir mejor el tejido exocrino que rodea los islotes1. Además, esta técnica…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos a la Sra. Jennifer Munguia por su ilustración artística del diagrama esquemático. Agradecemos al Sr. Michael R. Honig en la Community Public Radio Station KPFT de Houston por su asistencia editorial. Este estudio fue apoyado por la Asociación Americana de la Diabetes #1-15-BS-177 (YS), y NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). Este trabajo también fue apoyado por el Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura del USDA, el proyecto Hatch 1010840 (YS) y el R01 DK095118 (SG).
Materials
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
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