Fabricage van tong extracellulaire Matrix en reconstructie van tong plaveiselcelcarcinoom In Vitro
Summary
Een methode is hier weergegeven voor de voorbereiding van de tong extracellulaire matrix (TEM) met efficiënte decellularization. De TEM kan worden gebruikt als functionele steigers voor de wederopbouw van een tong plaveiselcelcarcinoom (TSCC) model onder statische of stirred cultuuromstandigheden.
Abstract
De methoden zijn om te bouwen van een model voor effectieve en realistische voor tong squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, gemaakt naar producten decellularized tong extracellulaire matrix (TEM) waarmee functionele steigers voor TSCC bouw. TEM voorziet een niche in vitro celgroei, differentiatie en cel migratie. De microstructuren inheemse extracellulaire matrix (ECM) en biochemische composities bewaard in de decellularized matrix wordt voorzien dat weefsel-specifieke niches verankering van cellen. De fabricage van TEM kan worden gerealiseerd door deoxyribonuclease (DNase) spijsvertering gepaard met een ernstige van organische of anorganische voorbehandeling. Dit protocol is eenvoudig te bedienen en zorgt voor een hoog rendement voor de decellularization. De TEM toonde gunstige cytocompatibility voor TSCC cellen onder statische of stirred kweekomstandigheden, waardoor de bouw van de TSCC model. Een zelf-gemaakte bioreactor werd ook gebruikt voor de aanhoudende stirred voorwaarde voor celkweek. Gereconstrueerde TSCC met behulp van TEM toonde de kenmerken en eigenschappen die lijken op klinisch TSCC Histopathologie, het potentieel in TSCC onderzoek suggereert.
Introduction
De tong heeft verschillende belangrijke functies, zoals deglutition, articulatie en proeverij. Dus, de verslechtering van de tong functie heeft grote impact op patiënten levenskwaliteit1. De meest voorkomende maligniteit in de mondholte is tong plaveiselcelcarcinoom (TSCC), die meestal voorkomt bij mensen die drinken van alcohol of roken van tabak2.
In de afgelopen jaren, is weinig vooruitgang geboekt in fundamenteel onderzoek op TSCC. Het gebrek aan efficiënte in vitro onderzoek modellen blijft als een van de grootste problemen. Dus, de extracellulaire matrix (ECM) blijkt te zijn van een mogelijke oplossing. Aangezien ECM een complex netwerk frame samengesteld uit onderdelen van de hoogst georganiseerde matrix is, zou Steiger materiaal met een ECM-achtige structuur en samenstelling bevoegd voor kankeronderzoek zijn. Decellularized ECM kan perfect de niche bieden voor de cellen van dezelfde oorsprong in vitro, die blijkt te zijn van het belangrijkste voordeel van ECM.
ECM kan worden bewaard met cellulaire componenten wordt verwijderd uit de weefsels door middel van de decellularization met behulp van detergentia en enzymen. Verschillende ECM componenten, met inbegrip van collageen, fibronectine en laminin in de decellularized matrix bieden een native-weefsel-achtige communicatie voor gekweekte cellen, bevordering van de overleving, proliferatie en differentiatie van de cellen3. Bovendien kan de immunogeniciteit voor transplantatie worden gereduceerd tot een minimaal niveau aan de afwezigheid van cellulaire componenten in ECM.
Tot nu toe hebben fabricage methoden voor decellularized ECM geprobeerd in verschillende weefsels en organen, zoals hart4,5,6,7, lever8,9,10 ,11, Long12,13,14,15,16,17, en nier18,19 , 20. echter geen relevant onderzoek is te vinden op soortgelijke werkzaamheden in de tong om het beste van onze kennis.
In deze studie werd decellularized tong extracellulaire matrix (TEM) zowel efficiënt en goedkoop vervaardigd door een reeks van fysieke, chemische en enzymatische behandeling. Vervolgens werd de TEM gebruikt om te recapituleren TSCC in vitro, tonen een passende simulatie voor TSCC gedrag en ontwikkeling. TEM heeft goede biocompatibiliteit, evenals de mogelijkheid om te begeleiden van de cellen naar de weefsel-specifieke niche, waarmee wordt aangegeven dat de TEM groot potentieel in TSCC onderzoek3 wellicht. Het hier getoonde protocol biedt u de keuze voor onderzoekers bestuderen op pathogenese of klinische therapieën voor TSCC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een goed gangbaar protocol voor de fabricage van decellularized ECM moet behouden de oorspronkelijke samenstelling van de ECM tijdens het verwijderen van cellulaire componenten in weefsels bijna volledig21. Ondanks momenteel gerapporteerde decellularization protocollen waarvoor perfusie door middel van de therapieën materialen te verwijderen cellulaire door convectie vervoer, mechanische agitatie goedgekeurd hier, bekend als een traditionele, eenvoudige en goedkope methode22</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de steun van onderzoekssubsidies van nationale Natural Science Foundation van China (31371390), het programma van de staat High-Tech ontwikkelingsproject (2014AA020702) en het programma van Guangdong wetenschap en technologie (2016B030231001).
Materials
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
References
- Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
- Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
- Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
- Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059 (2012).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
- Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
- Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
- Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
- Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
- Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).
