Изготовление язык внеклеточного матрикса и воссоздание язык плоскоклеточный рак в пробирке
Summary
Метод здесь показан для подготовки язык внеклеточного матрикса (ТЕА) с эффективным decellularization. ТЕА может использоваться как функциональные подмости для реконструкции модели плоскоклеточный рак (ККТС) язык в условиях статического или перемешивают культуры.
Abstract
Для того, чтобы построить эффективную и реалистичную модель для язык плоскоклеточный рак (ККТС) в пробирке, методы были созданы для производства decellularized язык внеклеточного матрикса (ТЕА) которая обеспечивает функциональные леса для строительства ККТС. ТЕА обеспечивает в vitro нишу для роста клеток, дифференциация и миграции клеток. Микроструктур родной внеклеточного матрикса (ECM) и биохимические композиций, сохранить в матрице decellularized обеспечивают ткани конкретных ниш для закрепления клетки. Изготовление ТЕА может быть реализована путем пищеварение дезоксирибонуклеаза (DNase), сопровождается серьезным органических или неорганических предварительной обработки. Этот протокол проста в эксплуатации и обеспечивает высокую эффективность для decellularization. ТЕА показал благоприятные cytocompatibility для ККТС клеток в условиях статического или перемешивают культуры, который позволяет построение модели ККТС. Самодельные биореактор использовался также для стойких перемешивают условия для клеточной культуры. Реконструированный ККТС, используя ТЕА показал характеристики и свойства, напоминающие клинических ККТС гистопатология, предлагая потенциал в области исследований ККТС.
Introduction
Язык имеет различные важные функции, такие как глотания, артикуляции и дегустации. Таким образом нарушение функции язык имеет большое влияние на качество жизни пациентов1. Наиболее распространенным злокачественности в ротовой полости является язык плоскоклеточный рак (ККТС), который обычно возникает у людей, которые пьют алкоголь или дыма табака2.
В последние годы был достигнут незначительный прогресс в фундаментальных исследованиях по ККТС. Отсутствие эффективных в vitro исследования моделей остается одним из самых больших проблем. Таким образом внеклеточная матрица (ECM) оказывается возможного решения. Так как ECM является сложной сети кадр состоит из компонентов высокоорганизованных матрицы, эшафот материалы, имеющие ECM-как структура и состав бы компетентным для исследований рака. Decellularized ECM может прекрасно обеспечить нишу для ячеек из той же происхождения в пробирке, который оказывается наиболее существенным преимуществом ECM.
ECM может быть сохранена с клеточных компонентов, удаляется из тканей через decellularization, с использованием моющих и ферментов. Различные компоненты ECM, включая коллаген, фибронектин и Ламинин decellularized матрицы обеспечивают микроокружения родной ткань как для культивируемых клеток, содействия выживанию, пролиферации и дифференцировки клеток3. Кроме того иммуногенность для трансплантации снижается до минимального уровня с отсутствием клетчатых компонентов в ECM.
До настоящего времени были опробованы методы изготовления для decellularized ECM в различных тканях и органах, таких как сердце4,5,6,7, печени8,9,10 ,11, легких12,13,14,,1516,17и18,почек19 , 20. Однако, не соответствующие исследования показали на аналогичную работу на языке, в меру наших знаний.
В этом исследовании decellularized язык внеклеточного матрикса (ТЕА) был сфабрикованы ряда физических, химических и ферментативные лечение эффективно и недорого. Затем ТЕА был использован для пилки ККТС в пробирке, показаны соответствующие моделирования ККТС поведения и развития. ТЕА имеет хорошие биосовместимость, а также способность направлять клетки ткани конкретных нишу, которая указывает, что ТЕА может иметь большой потенциал в ККТС исследований3. Протокол, показанный здесь обеспечивает выбор для исследователей, изучение патогенеза или клинической терапии ККТС.
Protocol
Representative Results
Discussion
Устоявшихся протокол для decellularized ECM изготовления следует сохранить родной ECM состав при удалении клетчатых компонентов в тканях почти полностью21. Несмотря на в настоящее время сообщил decellularization протоколов, которые требуют перфузии через сосудистую удалить ячеистых матер?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают поддержки научно-исследовательских грантов от национального фонда естественных наук Китая (31371390), программа проекта развития хай-тек (2014AA020702) и программа Гуандун науки и технологии (2016B030231001).
Materials
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
References
- Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
- Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
- Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
- Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059 (2012).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
- Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
- Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
- Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
- Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
- Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).
