Titolazione ELISA come un metodo per determinare la costante di dissociazione dell'interazione ligando del recettore

Summary

Un protocollo dettagliato per eseguire una titolazione ELISA è descritto. Inoltre, un algoritmo di romanzo è presentato per valutare titolazione ELISAs e ottenere una costante di dissociazione di legame di un ligando solubile ad un recettore di immobilizzato piastra di microtitolo.

Abstract

La costante di dissociazione viene descritta l’interazione tra due partner nell’equilibrio associazione ed è una misura della loro affinità. È un parametro fondamentale per confrontare diversi ligandi, per esempio, inibitori competitivi, isoforme della proteina e mutanti, per la loro forza vincolante ad un partner di associazione. Costanti di dissociazione sono determinate tracciando le concentrazioni di associato contro gratis ligando come curve di associazione. Al contrario, le curve di titolazione, in cui un segnale che è proporzionale alla concentrazione del ligando associato viene tracciato contro la concentrazione totale di ligando aggiunto, sono molto più facili da registrare. Il segnale può essere rilevato spettroscopicamente e dall’analisi enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA). Questo è esemplificato in un protocollo per una titolazione test ELISA che misura l’associazione del rhodocetin di derivata da veleno di serpente al proprio dominio di destinazione immobilizzato dell’integrina α2β1. Titolazione ELISAs sono versatile e ampiamente utilizzati. Qualsiasi coppia di proteine interagenti utilizzabile come immobilizzato recettore e ligando solubile, purché entrambe le proteine sono pure, e le loro concentrazioni sono noti. La difficoltà è stata finora per determinare la costante di dissociazione da una curva di titolazione. In questo studio, è stato introdotto una funzione matematica sottostante curve di titolazione. Senza qualsiasi stima errori grafico di una resa di saturazione, questo algoritmo consente l’elaborazione dei dati grezzi (intensità del segnale a differenti concentrazioni di ligando aggiunto) direttamente dalla valutazione matematica tramite regressione non lineare. Così, diverse curve di titolazione possono essere registrate simultaneamente e trasformate in un set di parametri caratteristici, tra cui la costante di dissociazione e la concentrazione del recettore vincolante-attivo, e possono essere valutati statisticamente. Quando combinato con questo algoritmo, titolazione ELISAs guadagnare il vantaggio di presentare direttamente la costante di dissociazione. Pertanto, essi possono essere utilizzati in modo più efficiente in futuro.

Introduction

La costante di dissociazione K è un parametro fondamentale per descrivere l’affinità di un recettore (R) per il suo ligando (L). Basato sulla legge di azione di massa, K è definito per l’equilibrio, in cui il RL complesso recettore-ligando si dissocia nel recettore R e il ligando l:

            Equazione 1

con gli indici f che indica lo stato di libero/non legata del recettore e ligando. La concentrazione del complesso recettore-ligando, RL, è identica alla concentrazione del ligando del recettore associato Lb. Come la concentrazione totale dei recettori Rt è la somma del recettore libero Rf e recettore-ligando Rb = Lb, la costante di dissociazione può essere scritta anche come:

        Equazione 2

Quindi, la saturazione rendimento Y, definita come la frazione di ligando associato Lb in relazione alla concentrazione totale di recettore Rt,

        Equazione 3

dipende dalla concentrazione del ligando libero Lf:

        Equazione 4

Questa relazione iperbolica descrive la curva di associazione di un’interazione recettore-ligando e sua trama indica la concentrazione del ligando associato Lb in funzione della concentrazione del ligando libero Lf. Dalla curva di associazione, la costante di dissociazione K può essere derivata come la concentrazione del ligando libero allo snervamento mezzo massima saturazione. Inoltre, sono stati istituiti diversi algoritmi per linearizzare le curve di associazione, come la trama di doppio-reciproco di Klotz^1,2, o trasformazioni secondo Scatchard o Hanes (Recensito da Bisswanger³). Tuttavia, tutti gli algoritmi soffrono il problema che il valore massimo del rendimento saturazione, che si avvicina asintoticamente ad alte concentrazioni di ligando libero della curva di associazione, deve essere stimato in una pre-valutazione grafica e pertanto è soggetta a errori.

Inoltre, la determinazione di una curva di associazione richiede la quantificazione del ligando libero e rilegato durante l’equilibrio di associazione. A tal fine, il ligando libero deve essere separato dal ligando-recettore associato e quantificato. Di conseguenza, il ligando e recettore necessario differiscono nelle loro proprietà, ad esempio un ligando non proteici in contrasto con un ricevitore della proteina. Se entrambi i partner di associazione sono proteine, devono essere distinguibili nelle loro dimensioni, spese o altre caratteristiche molecolari. Tuttavia, la quantificazione delle concentrazioni di ligando in approcci di associazione su piccola scala è un compito difficile. Etichettatura radioattivo del ligando spesso è stato necessario per rilevare la bassa concentrazione del ligando associato, soprattutto se notevoli quantità di recettori non erano disponibili o accessibili. Inoltre, il ligando del recettore associato può dissociare durante e dopo l’isolamento in maniera non trascurabile. Quindi, metodi complessi, come equilibrio gel filtrazione⁴, elettroforesi capillare⁵e impulso proteolisi⁶, sono tenuti a quantificare il ligando del recettore associato e separarlo dal ligando libero.

In contrasto con queste analisi obbligatorie, esperimenti di titolazione non richiedono la separazione quantitativa del ligando legato e libero. A tal fine, un recettore ad una concentrazione costante viene titolato con differenti concentrazioni di ligando aggiunto. Legandosi al recettore, il ligando associato dispone di una proprietà biofisica che lo distingue dal ligando libero ed è misurabile con, per esempio, fotometria, fluorimetria o rilevazione dell’anticorpo. Così, un segnale S, che è proporzionale alla saturazione resa Y e di conseguenza anche alla concentrazione del ligando del recettore associato (Lb), è rilevato come una funzione della concentrazione totale di aggiunto ligand (Lt). Entrambi i parametri, il segnale S e la concentrazione totale di ligando aggiunto sono quantificati in modo diretto e agevole rispetto le concentrazioni di ligando legato e libero. In particolare, la rilevazione del ligando del recettore associato di analisi enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA) ha permesso la riduzione dei volumi di campione di sotto 100 µ l e misurazioni parallele di diverse concentrazioni di ligando anche in multi-pozzetto di microtitolo. In una titolazione ELISA, un recettore è fisicamente adsorbito alla micropiastra alla stessa concentrazione e titolato con legante solubile. Il recettore è immobilizzato per la superficie di plastica essenzialmente mediante adsorbimento idrofobo. La concentrazione della superficie di recettore immobilizzato correla con la concentrazione di rivestimento del recettore in una relazione non lineare, probabile secondo Langmuir´s adsorbimento isoterma⁷. Oltre al numero totale di molecole adsorbite recettore, il loro stato di attività è un altro parametro importante per le analisi di titolazione. Solo immobilizzato i ricevitori che hanno mantenuto l’attività di legame del ligando, sono rilevanti per il dosaggio di titolazione e infine contribuiscono alla concentrazione totale di recettori attivi Rt del test di titolazione, che non può essere determinato direttamente.

Siti sulla superficie di plastica, che non sono coperti dal recettore immobilizzato sono inclini ad assorbire altre proteine, come il ligando. Adsorbimento fisico del ligando a tali siti di superficie in plastica si tradurrebbe in un segnale simile come il ligando del recettore associato, ma in un modo non specifico. Per ridurre questo segnale aspecifico, i siti di superficie plastica delle piastre micrometodi che non sono state rivestite con proteina ancora verranno bloccate con albumina di siero bovino (BSA). Tuttavia, per alcuni test di titolazione del recettore-ligando, segnali aspecifici sfondo possono essere osservati. Poi, altri agenti di blocco, ad esempio una soluzione di 0,2% di gelatina o di 0,04% Tween 20, sono raccomandati.

Dopo il legame al recettore, il ligando libero viene rimosso mediante due passaggi del lavaggio. Ligando associato rimane con il recettore, che è immobilizzato per la superficie di plastica del pozzo microtitolo e facoltativamente rinforzato tramite la fissazione chimica. Per i successivi covalenti legame incrociato di associato ligando e recettore immobilizzato con glutaraldeide, la sostanza tampone TRIS è sostituita per HEPES, senza alcun cambiamento nel grippaggio del ligand. HEPES, in contrasto con TRIS, non inattivare glutaraldeide. Il legame covalente incrociato con glutaraldeide corregge il ligando associato con il suo recettore e impedisce la sua dissociazione durante i passaggi successivi di lavaggio e di incubazione. Così, l’interazione recettore-ligando chimicamente è congelato e garantisce una curva di titolazione che risente delle successive fasi di lavaggio e di incubazione. Tuttavia, la fissazione di glutaraldeide può modificare chimicamente il ligando e recettore in modo tale che la loro interazione è ridotto o abolito. Inoltre, modifica degli epitopi entro il ligando può modificare l’affinità di legame dell’anticorpo di rilevazione, soprattutto se un anticorpo monoclonale è utilizzato per quantificare il ligando associato. Anche se nessuno di questi effetti avversi della fissazione in glutaraldeide si verifica in questa titolazione ELISA, la sensibilità del test verso glutaraldeide dovrà essere testata per ogni interazione recettore-ligando prima dell’esperimento di titolazione. Dopo la fissazione, glutaraldeide in eccesso viene rimosso in tre lavaggi con tampone TRIS-contenente. TRIS inattiva restanti gruppi di aldeide, che non specifico potrebbero reagire con il rilevamento di anticorpi nel passaggio successivo.

La quantità di legante associato viene quantificata con gli anticorpi enzima-collegata, che forniscono un segnale fotometrico di ELISA S. Ciò è tracciata contro il ligando totale concentrazione Lt aggiunti a ciascun pozzetto. Nonostante la sua più facile acquisizione, la curva di titolazione non è una funzione iperbolica in contrasto con la curva di associazione. Inoltre, esso è stato poco chiaro come calcolare la costante di dissociazione K da una curva di titolazione. Anche se gli algoritmi per linearizzare le curve di titolazione spettroscopicamente acquisite sono stati riportati indipendentemente da Stockell⁸ e Heyn e Weischet⁹, sono caduto breve a causa della loro incertezza di stimare il segnale massimo valore che il resa di saturazione si avvicina alle alte concentrazioni di ligando aggiunto.

Qui, una titolazione ELISA e un algoritmo di regressione non lineare sono descritti per ricavare la costante di dissociazione K per un’interazione ligando del recettore da una curva di titolazione. Questo protocollo è esemplificato per l’interazione tra il dominio di A collagene-associazione dell’integrina α2β1 con un inibitore di derivati da veleno di serpente. Le integrine sono molecole di adesione cellulare, che mediano l’ancoraggio delle cellule alla matrice extracellulare circostante o il sottostante membrana basale^10,11. Inoltre, le integrine trasmettono segnali importanti tra cellule e matrice extracellulare con l’assunzione di ulteriori molecole di segnalazione e formando nuovi organelli delle cellule, adhesomes, su cellula-matrice interazione^{12,13, 14}. il collagene, il ligando di integrina α2β1, è la proteina più abbondante del corpo umano ed è un componente fondamentale dell’armatura del tessuto connettivo¹⁵. L’interazione tra integrina α2β1 e collagene è mediata dal dominio della subunità α2 integrine. L’integrina α2A-dominio contiene un catione bivalente, che è necessaria per l’associazione di collagene e stabilizza la sua struttura. Il selvaggio-tipo modulo nonché mutanti del dominio α2A, ad esempio quella in cui il residuo di superficie-esposta Y216 era stato sostituito per una glicina, possono essere facilmente prodotta recombinantly in un sistema di espressione batterica e isolati tramite loro oligo-His-tag con un NiNTA colonna di SuperFlow con una successiva dialisi contro di 2 mM MgCl₂contenente soluzione fisiologica tamponata (TBS; 50 mM TRIS/HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl)¹⁶. Le loro concentrazioni sono state determinate con l’analisi di acido bicinconinico (BCA) e loro purezze sono testate da convenzionale SDS-PAGE e macchiate con Coomassie Brilliant Blue R250.

L’interazione tra integrina α2β1 e collagene è bloccato dall’associazione del componente di veleno di serpente, rhodocetin, dalla vipera di pozzo malese (Calloselasma rhodostoma)^16,17. Usato come un legante solubile in questa titolazione ELISA, rhodocetin è stato purificato dal greggio veleno come descritto in precedenza¹⁶. Esso è disciolto in soluzione salina tamponata HEPES (HBS; 10 mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 150 mM NaCl) ed è conservato congelati a-20 ° C. La sua concentrazione è stata determinata da BCA e la sua purezza è stata dimostrata da SDS-PAGE. Come antagonista, rhodocetin non solo blocca collagene vincolanti per l’integrina α2β1 dominio, ma inoltre stabilizza la conformazione inattiva dell’integrina impedendo qualsiasi segnalazione da collagene nelle cellule o piastrine¹⁸. È di grande importanza biomedica per determinare la costante di dissociazione di rhodocetin con il suo obiettivo di recettore e svelare così il meccanismo molecolare e farmaceutici potenziali ad es., come agente antitrombotico. A tal fine, una titolazione ELISA è descritto compreso la sua valutazione, che è applicabile a quasi qualsiasi interazione recettore-ligando con una stechiometria 1:1 interazione.

Protocol

1. magazzino soluzioni Per preparare 100 mL di 10 x TBS soluzione a pH 7,4, sciogliere 6,06 g di TRIS e 8,77 g di NaCl in 90 mL di acqua deionizzata, regolare il pH a 7.4 con soluzione di HCl 37%, riempire il volume a 100 mL con acqua deionizzata e filtrare la soluzione. Per preparare 100 mL di 1 M HEPES/NaOH, soluzione a pH 7,4, sciogliere g 23,83 di HEPES in 90 mL di acqua deionizzata, regolare il pH a 7.4 con 1,5 M NaOH, riempire il volume a 100 mL con acqua deionizzata e filtrare la soluzione.</li…

Representative Results

Dopo il test ELISA è stato sviluppato, il colore giallo del substrato fosfatasi alcalina convertito, para- nitrofenolato di sodio, indica che la quantità di legante associato rhodocetin diminuisce con la diminuzione delle concentrazioni di rhodocetin aggiunto da colonne da 1 a 11 (Figura 1). L’incolore wells nei pozzetti privo di rhodocetin nella colonna 12 Visualizza un segnale di basso fondo. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa…

Discussion

La titolazione ELISA è un sistema versatile per determinare la dissociazione di un’interazione recettore-ligando. Come la titolazione ELISA elude la necessità di separare i leganti liberi e rilegati in modo efficace e per analizzare quantitativamente, le loro concentrazioni sostanzialmente più studi e pubblicazioni hanno impiegato titolazione ELISAs invece di registrare curve di associazione . Inoltre, titolazione ELISAs sono facili da eseguire e richiedono ragionevolmente basse quantità di recettore e ligando. Per u…

Materials

TRIS	neoFrox	1125KG001
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
NaCl	Applichem	1,316,591,214
MgCl2	Merck	172571
integrin a2A, wild-type and mutant, recombinant		isolated in author's lab
NiNTA superflow column	Qiagen, Germany	30821
Coomassie-Brilliant Blue R250	Serva	35050
bicinchoninic acid assay (BCA), protein concentration determination kit	Fisher Scientific	23225
bovine serum albumine (BSA), fraction V	Applichem	A1391
25 % solution of glutaraldehyde	Merck	354400
anti-rabbit immunglobulin-antibodies from goat, conjugated with alkaline phosphatase	Sigma-Aldrich	A9919
Glycine	Applichem	A1377
Zn(II)-acetate	Applichem	A4324
NaOH	Applichem	A1551
Alkaline phosphatase substrate tablet (5 mg)	Sigma-Aldrich	S0942
Costar half-area microtiter plate	Thermo Scientific	Corning 3690
micro reaction tubes	Eppendorf	30120086
Microplate ELISA reader	BioTek	Synergy HT