Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans
Summary
In diesem Artikel zeigen wir live Darstellung der einzelnen Würmer mit einem benutzerdefinierten mikrofluidischen Gerät. In das Gerät beschränken sich mehrere Würmer individuell separate Kammern, Multiplex längs Überwachung der verschiedenen biologischen Prozesse ermöglicht.
Abstract
In den letzten zehn Jahren mikrofluidischen Techniken angewendet wurden, um kleine Tiere, einschließlich der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans, zu studieren und haben sich bewährt als praktisch live imaging Plattform bietet Funktionen für präzise Steuerung der experimentellen Bedingungen in Echtzeit. In diesem Artikel zeigen wir live Darstellung der einzelnen Würmern beschäftigt WormSpa, ein zuvor veröffentlichten benutzerdefinierten mikrofluidischen Gerät. In das Gerät beschränken sich mehrere Würmer individuell separate Kammern, Multiplex längs Überwachung der verschiedenen biologischen Prozesse ermöglicht. Um die Funktion zu veranschaulichen, haben wir Proof of Principle Experimenten, in denen Würmer im Gerät mit pathogenen Keimen infiziert wurden, und die Dynamik des Ausdrucks der Immunantwort Gene und Eiablage wurden in einzelnen kontinuierlich überwacht Tiere. Einfache Planung und Betrieb dieses Gerätes machen es für Benutzer ohne Vorkenntnisse mit mikrofluidischen basierenden Experimente geeignet. Wir schlagen vor, dass dieser Ansatz nützlich für viele Forscher in Längsrichtung Beobachtungen biologischer Prozesse unter genau definierten Bedingungen interessiert sind.
Introduction
Veränderungen der Umweltbedingungen führen zu einer Aktivierung des genetischen Programme, die begleitet von Induktion und Unterdrückung der Expression bestimmter Gene1,2. Diese kinetische Änderungen möglicherweise Variable unter Gewebe in den gleichen Tieren und zwischen den verschiedenen Tieren. Studien über solche genetische Programme fordern daher Methoden, die ermöglichen längs-Bildgebung einzelner Tiere und dynamische Kontrolle der Umweltbedingungen.
In den letzten Jahren wurden Microfabricated fluidischen Geräten verwendet, um viele Aspekte der Reaktion und Verhalten bei kleinen Tieren, darunter Würmer, fliegen, Bärtierchen und weitere3,4,5,6zu studieren, 7. Anwendungen sind zum Beispiel Tiefe Phänotypisierung, optogenetische Aufzeichnung von neuronaler Aktivität in Reaktion auf chemische Reize und Nachverfolgung der motorischen Verhaltensweisen wie Fortbewegung und Pumpen8,9,10 , 11.
Mikrofluidik-basierte Ansätze halten viele Eigenschaften, die langfristige längs Bildgebung der Reaktion auf ökologische Hinweise, einschließlich präzise dynamische Steuerung der lokalen Mikroumgebung, flexibles Design, das ermöglicht die Aufrechterhaltung der profitieren könnten einzelne Tiere in getrennten Bereichen und günstige Eigenschaften für die Bildgebung. Pflege Tiere in einer mikrofluidischen Kammer für eine lange Zeit mit minimalen negativen Auswirkungen auf ihre gut Wesen ist jedoch eine Herausforderung, die besonderen Sorgfalt bei der Gestaltung von mikrofluidischen Gerät sowie bei der Durchführung des Experiments erfordert.
Hier zeigen wir die Verwendung von WormSpa, einem mikrofluidischen Gerät für die longitudinale Bildgebung von Caenorhabditis Elegans. 5 einzelne Würmer beschränken sich in Kammern. Niedrige Zufuhr von Flüssigkeit und bakterielle Federung gewährleistet, dass Würmer sind gut gefüttert und ausreichend aktiv zur Erhaltung guten Gesundheits und Stress zu lindern, und die Struktur der Kammern Würmer Eier legen. Die Einfachheit der Konstruktion und Betrieb von WormSpa sollte Forscher ohne Vorkenntnisse Mikrofluidik, dieses Gerät in ihre eigenen Forschungsvorhaben zu integrieren ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikrofluidische Tools bieten mehrere Vorteile bei der Untersuchung von Würmern. Bildgebung in einem PDMS bietet Gerät höhere Bildqualität im Vergleich zu einer standard NGM-Agar-Platte. Mehrere Bilder können ein einziger Wurm, im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden entnommen werden, in denen Tiere abgeholt von der Platte und montiert auf einen Objektträger für die Bildgebung. Darüber hinaus kann der Mikroumgebung, in denen Würmer befinden sich, konstant oder modulierte wie gewünscht, erlaubt präzise Zuordnung…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde unterstützt durch die National Science Foundation durch Zuschüsse PHY-1205494 und MCB-1413134 (EL) und die National Research Foundation of Korea Grant 2017R1D1A1B03035671 (KSL).
Materials
| WormSpa | N/A | N/A | The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab. |
| Compound Microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | An inverted fluorescence microscope with a motorized stage |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| Tubing | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D |
| Syringe Tip | CMLsupply | 901-20-050 | 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula |
| Syringe Filter | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane |
| Syringe | Qosina | C3307 | 10 mL Male Luer Lock Syringe |
| 3 Way Valve | ColeParmer | FF-30600-23 | Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile |
| Dowel Pin | McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.) |
| Low Binding Microcentrifuge Tube | Corning | CL S3206 | 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube |
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