Embriyolardan kromozomların böcek Spermatocytes
Summary
Bu protokol için seçim ve uygun hücreler embriyolardan için hazırlanması ve piezoelektrik micromanipulator kullanımı bu hücrelerde kromozom yeniden konumlandırmak için açıklar.
Abstract
Kromozomların embriyolardan kromozom congression, iğ denetim noktası ve anafaz kromozom taşımalar için mekanizma aydınlatıcı için gerekli bir yöntem olmuştur ve ne kromozom hareketlerini kontrol anlamanın anahtarı olmuştur hücre bölünmesi sırasında. Yetenekli bir biyolog bir micromanipulator kromozomlar iğ, kromozomlar hücrenin içinde yeniden konumlandırmak için ve kuvvetler küçük cam iğne ile çok iyi bir ipucu kullanarak kromozomlar uygulamak için gelen ayırmak için kullanabilirsiniz. Süre tedirginlikler kromozomlar optik yakalama gibi diğer yöntemleri ve diğer kullanımlar bir lazer kullanılarak yapılmış, bugüne kadar başka bir yöntem onlarca yüzlerce mikron az hücre hasar yok olan ölçekte hücresel bileşenleri yeniden konumlandırma sağlar .
Seçim ve özellikle canlı hücre görüntüleme ve embriyolardan, kullanımda çekirge ve kriket spermatocyte birincil kültürlerinin hazırlanması açıklayan kromozomların embriyolardan için uygun hücre hazırlık Burada açıklanan. Buna ek olarak, biz ona bağlı bir cam iğne ile kromozomlar hücrenin ve bir joystick kontrol edilen piezoelektrik micromanipulator kullanımı içinde hareket etmek için kromozomlar sayesinde bunun bölünen hücreler içinde yeniden konumlandırmak için kullanılmak üzere bir iğne inşaatı gösteriyor. Bir örnek sonuç bir kromozom bir mil içinde bir birincil spermatocyte dan ayırmak için ve bu kromozom hücre içinde yeniden konumlandırmak için bir micromanipulator kullanımını göstermektedir.
Introduction
Embriyolardan bir kromozom congression, iğ denetim noktası ve anafaz kromozom taşımalar için mekanizma parçaları ortaya koymuştur. Embriyolardan deneylerin sonuçlarını açıklayan ilk yayın Robert Chambers1tarafından yapıldı. Chambers mekanik bir micromanipulator bir ekli cam iğneyle sitoplazma, farklı hücre tipleri birkaç soruşturma eskiden. Kromozomlar ve birçok diğer hücresel bileşenleri canlı hücrelerdeki görselleştirme izin kontrast yöntemleri ne yazık ki, o zaman mevcut değildi, bu yüzden Chambers deneyler gibi hücresel bileşenleri yeniden konumlandırma etkileri göstermiyor. Kromozom konumu değişmiş erken micromanipulations Chambers aparatı böyle manipülasyonlar anafaz çekirge neuroblasts2 kromozom silah konumunu değiştirmek gösterilen iğ midzone anafaz hücrelerdeki süpürme eskiden . Nicklas ve işbirlikçileri kromozom3germe, onları iğ ayırma ve sabitleme bir hale gelmesini3,4, inducing kromozom, iyi micromanipulations gerçekleştirmek için ilk idi bir gerginlik kromozom5,6,7uygulama ve anafaz8,9mil sayısı tarafından üretilen kuvvetleri ölçerek malorientation. Diğer iş Nicklas laboratuvar tarafından sitoplazmik granüller işlenmiş10 de olabileceğini ve centrosomes embriyolardan11tarafından yeniden konumlandırılmış gösterdi. Embriyolardan sadece kromozomlar ve diğer hücresel bileşenleri taşımak için kullanışlı değildir. Embriyolardan iğne temiz bir şekilde mitotik iğ demembranated hücreler12 yoluyla kesebilir veya nükleer zarf13dağıtılması için kullanılabilir. Buna ek olarak, bitişik hücreleri embriyolardan14,15tarafından erimiş.
Böyle bir yelpazede yapılabilir ilginç deneyler ile embriyolardan kullanarak, ilk bakışta şaşırtıcı embriyolardan deneyler çok az kromozom biyologlar tarafından yapılmıştır. Bu eksikliği için bir nedeni omurgalı dokulardan türetilir ve kromozom hareketleri eğitimi için yaygın olarak kullanılan mitotically bölme kültürlü hücreleri micromanipulate için son derece zor olmasıdır. Bu doku kültürü hücreler genellikle bir kortikal sitoiskeleti “embriyolardan engel” iğne ve kromozomlar da iğne tarafından erişilemiyor veya bir hücre rüptürü ve ölüm önde gelen hücreye iğne biler var. Biz ve embriyolardan, kullanan diğer Denemecileri embriyolardan için mükellef olması için eklem bacaklılar hücreleri bulduk. Eklem bacaklılar spermatocytes kolayca halocarbon yağ tabakası altında yayılır ve daha az güçlü bir kortikal sitoiskeleti hücre membran hücre bölünmesi sırasında temel gibi görünüyor. Böylece, eklem bacaklılar testis meiotically bölünmesi hücre (spermatocytes) iyi bir kaynağı sağlamak ve mitotically bölme (spermatogonia) embriyolardan için kolayca erişilebilir kromozom ile hücreleri. Düzenleme sırasında sabit bir çekirge spermatocyte bir seri kesit iğneyi asla hücre zarı nüfuz ortaya; hücre zarının iğne (Nicklas R.B., kişisel iletişim) deforms. Spermatocytes böcek ve örümcek özellikleri bir dizi micromanipulated başarıyla, çekirge, dua eden mantids, meyve sinekleri, Vinç sinekler, cırcır, spittlebugs, pervane, kara dul örümcekler, Bodrum örümcekler ve küre-dokuma örümcekler edilmiştir 3,7,17,18,19,20,21,22. Böcekler kültürlü, mitotically bölme hücrelerden micromanipulated olabilir. Örneğin, birincil bir kültür çekirge neuroblasts kromozomlar kolayca-ebilmek var olmak micromanipulated2,23kromozom var. Biz bu hücreler ile teknik test etmedim ama mevcut Drosophila elde edilen satırları kültürlü ve diğer böcekler-ecek da var olmak micromanipulatable, şüpheli. Biz nasıl çekirge ve cırcır böcekleri hücre bölünmesi için embriyolardan hazırlanabilir gösterir. Cırcır böcekleri en evde beslenen hayvan stok–dan yılın herhangi bir zamanda elde etmek kolaydır. Çekirge, sadece sürece araştırmacı bir laboratuvar koloni erişebilir, ama kullanılan türler (Melanoplus sanguinipes) kolayca hücreleri ve uzun, kolay manipüle kromozomlar basık yaz aylarında kolayca elde edilebilecek.
Başka bir nedeni neden embriyolardan deneyler biyologlar küçük bir avuç tarafından yapılmıştır kromozomlar iyi hareket micromanipulators pazarda nadiren kullanılabilir olmasıdır. Biz bir joystick kontrol edilen piezoelektrik micromanipulator hiçbir titreşim, drift veya gecikme arasında joystick hareketi ve iğne hareketi ile iğne hareketi kontrol eder ama manipülatörler diğer türleri de başarıyla kromozomlar zorlayabilir bulduk çevresinde hücre. Eski teknolojiyi kullandıkları rağmen Ellis ve Begg25,26 tarafından tasarlanmış micromanipulators kromozomlar, embriyolardan için idealdir. Piezoelektrik micromanipulators mevcut ve yaygın olarak kullanılan Elektrofizyoloji içinde. Ancak, bu micromanipulators genellikle joystick kontrol edilen değildir. Joystick kontrolü için başarılı bir embriyolardan gerekli düzgün hareketleri anahtarıdır ve çok özel bir joystick için kromozom embriyolardan işe Şu anda mevcut piezoelektrik micromanipulators yapmak için inşa edilmelidir. En iyisi joystick kontrol edilen piezoelektrik micromanipulators joystick hareketi doğrudan bir iğne hareket çevirir doğrudan pozisyon kontrol var.
Yeni tasarlanmış piezoelektrik micromanipulator piyasada bulunan yerlerinden kolayca değiştirilebilir ve bazı küçük 3-b yazdırılan bileşenleri inşa ve de kromozom embriyolardan24için çalışıyor. Micromanipulator ayarlanabilir duyarlılık, el ile kaba konumlandırma ve hiçbir titreşim, drift veya doğrudan pozisyon kontrol iğne ve iğne hareket gecikme vardır. Bilim adamları talimatları mevcut online24kullanarak micromanipulator gerçekleştirebilmesi. Aşağıda bir birincil spermatocyte hücre kültür hazırlama ve micromanipulating yöntemler vardır o kültür hücreleri içinde kromozomlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uygulama ile kromozomlar hücre içinde hareket etme ikinci doğa olabilir. Yeterince sert ve yeterince ince uçlu iğneler “püf noktası,” zor imalatı, ama bu yetenek aynı zamanda uygulama ile geliyor. Halocarbon yağda taşındığında deforme ince iğneler hücrede kromozomlar itmek için yararlı olmayacaktır. Çok iğneler onların ipuçları görülebilir ve gibi büyük olarak 1/3 bir kromozom genişliğinin (ya da daha büyük) hücre öldürmek çok büyük olasılıkla künt. Kromozomlar itmek yeterince iy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jessica Hall onu değerli tartışma için teşekkür ederiz.
Materials
| VWR micro cover glass | VWR | 48366 249 | 25×25 mm, no 1.5 |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR | AA44224-KT | |
| KEL-F Oil #10 | Ohio Valley Specialty Chemical | 10189 | |
| Microdissecting Scissors, Stainless Steel | Sigma-Aldrich | S3271-1EA | |
| Dumont #5 fine foreceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube | Drummond Scientific | Custom order–call to request | |
| Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective | Any brand | ||
| microforge | either custom built or Narashige | MF-900 | |
| micromanipulator | either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick | PCS-6300 |
References
- Chambers, R. Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon. Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).
- Carlson, J. G. Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata. Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).
- Nicklas, R. B., Staehly, C. A. Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle. Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).
- Nicklas, R. B. Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis. Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).
- Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes. Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).
- Nicklas, R. B., Ward, S. C. Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension. Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Nicklas, R. B. Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase. Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).
- Nicklas, R. B. The forces that move chromosomes in mitosis. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).
- Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis. Chromosoma. 39 (1), 1026 (1972).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells. Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).
- Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules. Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).
- Nicklas, R. B. Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).
- Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes. Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).
- Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm. Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).
- Forer, A., Koch, C. Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes. Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).
- Camenzind, R., Nicklas, R. B. The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis. Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).
- Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae). Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).
- Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius. Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).
- Golding, A. E., Paliulis, L. V. Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution. PLoS One. 6, e24748 (2011).
- Doan, R. N., Paliulis, L. V. Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer). Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).
- Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension. Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).
- . . Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator. , (2018).
- Ellis, G. W. Piezoelectric micromanipulators. Science. 138 (3537), 84-91 (1962).
- Ellis, G. W., Begg, D. A., Zimmerman , . A. M., Forer, A. Chromosome micromanipulation studies. Mitosis/Cytokinesis. , 155-179 (1981).
- Powell, E. O. A microforge attachment for the biological microscope. Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).
- Alsop, G. B., Zhang, D. Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. Anaphase’ and cytokinesis in the absence of chromosomes. Nature. 382, 466-468 (1996).
