Summary

分離と大人住血吸虫から細胞外小胞のキャラクタリゼーション

Published: May 22, 2018
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Summary

ここでは、アダルト住血吸虫から培養体外細胞小胞 (Ev) の分離を記述するプロトコルを提案する.

Abstract

細胞小胞 (Ev) は、膜小胞の細胞外微小環境に様々 な細胞によって放出です。EVs は、異種の小胞の人口は 40 と 1,000 nm 間のサイズの範囲を表しています。蓄積された証拠は、EVs がホスト病原体の相互作用で重要な規制の役割を果たすことを示した。住血吸虫の EVs の深い理解は、住血吸虫ホスト相互作用、住血吸虫症に対する新しい戦略の開発を有効にするメカニズムに洞察力を提供しなければなりません。ここでは、さらにアダルト日本住血吸虫(S. ササユリ) から分離・同定 EVs のためのプロトコルを提示による住で EVs 機能を研究を目指しています。EVs は体外培養液遠心商業エキソソーム分離キットと組み合わせての使用から分離しました。分離されたs. ササユリEVs (SjEVs) は通常 100-400 nm の直径を持つし、透過電子顕微鏡と西部にしみが付くことによって特徴付けられます。PKH67 色素標識 SjEVs の使用は、SjEVs は受信者の細胞によって内面化を実証しています。全体として、我々 のプロトコルは大人住; から EVs を分離するための代替方法を提供します。分離 SjEVs の機能解析が適さない場合があります。

Introduction

細胞小胞 (Ev) は、様々 なタンパク質、脂質、核酸でカプセル化されます小さな膜結合型ベシクルの人口です。EVs が細胞間の情報伝達に重要な役割を果たして、細胞の分化、免疫調節、血管新生、セル移行2など多数の生理学的なプロセスの規則にかかわる最近の研究を実証 3,4,5。証拠の蓄積は、EVs を, 循環エクソソーム、および miRNA 貨物が特定疾患6の潜在的なバイオ マーカーを表すことを示します。

トリコモナスcruzi トリパノソーマの原因リーシュ マニア属などのいくつかの原生動物、EVs; を分泌することができることが示されている。寄生虫が見つかってまた7をホストの生活に EVs を分泌します。寄生 EVs 感染、病原性8、および免疫調節9の維持に関与することが示されています。住での最近の調査は両方のマンソン住血吸虫(マンソン住血吸虫など) 1011 S. ササユリ12アダルト住がありますエキソソームのような小胞を分泌することが示されています。特定の生物学的プロセスの機能の規則にかかわる。

日には、超遠心法、限外濾過法13イムノアフィニティーカラム分離、サイズ排除クロマトグラフィー, ポリマー ベースの試薬の使用など、細胞の小胞を分離するいくつかの方法を使用されています。これらの異なる方法では、独自の利点と制限14を所有しています。一般的に、遠心は小胞の分離のためのゴールド スタンダード メソッドと見なされます。ただし、このメソッドは、潜在的な EV 集計14の制限に苦しみます。

住、いくつかのメソッドは、EV の分離報告されている: 遠心11,12,10といくつかの段階 (卵16、商用 EV 分離キット16の利用が含まれますschistosomula11, アダルト住10,12,17)。ベンチの遠心分離機、限外濾過から EVs を分離するための市販 EV 分離キットの使用を組み合わせた代替法を開発した機構の解明は、1000 ナノメートル数百ナノメートルからのサイズの広い範囲が、アダルト日本住血吸虫。分離の EVs は、通常 100-400 nm の直径を所有し、正常に受信者の細胞によって内面化されました。

Protocol

上海中国農業科学院獣医研究所倫理委員会で承認されたすべての動物実験 (許可番号: SHVRIAU-14-0101)。 1住の体外培養。 注:住は、バイオハザードを表しています。労働者は関連生物学的材料をワーム、感染後懸濁液、または他を処理する場合もすべてのラテックス手袋を着用ください。ニュージーランドのウサギは、腹?…

Representative Results

記述のプロトコルを使用して孤立した SjEVs の収量を定量化するには、28 日アダルト住から分離された SjEVs の蛋白質の集中をアクセスするのに BCA タンパク質アッセイを使用しました。表 1に示すように、SjEV 蛋白質の集中は媒体 (表 1) の 100 mL あたり 250 μ g 208 μ g からであった。粒子サイズ モールヴァン ナノ粒子解析によって決定される表?…

Discussion

Ev に関する最近の研究は、EVs は、宿主-病原体相互作用3,9,12,16で重要な役割を果たす、住血吸虫を実証しています。さらにアドレスに規制機能のそれは住から EVs を分離するため不可欠であります。ここでは、SjEV の分離のための代替方法をについて説明します。このメソッドは、100 から、SjEVs の…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究は、一部または全部、国家自然科学基金、中国の (31472187 および 31672550) および農業科学と中国農業科学院の技術革新プログラムでサポートされています。

Materials

Material
Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) ThermoFisher SCIENTIFIC 4478359 For isolating S. japonicum extracellular vesicles
PKH67 Sigma-aldrich MINI67 For labeling Evs
RPMI 1640 Medium ThermoFisher SCIENTIFIC 11875119 For parasite culture
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher SCIENTIFIC 15140122
0.22μm syringe filter Merck SLGP033RB
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo SCIENTIFIC 68035
PEG8000 Sangon Biotech A100159 
RIPA Beyotime P0013B
EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Fisher scientific WBKLS0100 
DAPI Cell Signaling Technology 4083
BCA kit Beyotime P0010
CD63 antibodies Sangon Biotech D160973-0025
PVDF Bio-Rad 1704273
Formvar/Carbon 400 mesh Ted Pella 01754-F
Phosphotungstic Acid Ted Pella 19402
anti-mouse IgG-HRP CWBIO CW0102
NCTC clone 1469 cells ATCC ATCC® CCL-9.1™
FBS HyClone SV30087.02
Equipments
GE chemoluminescance imaging system GE ImageQuant LAS4000mini
Transmission electron microscopy Hitachi H-7600
Milli-Q water Milli-Q Milli-Q Elix
Eppendor Centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5804R
Zetasizer Nano Malvern Zetasizer Nano ZS 
Ultracentrifuge Beckman Optima L-100 XP Ultracentrifuge
Incubator ESCO CCL-107B
Microscope Zeiss Zeiss Axin Observer Z1

References

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Cite This Article
Liu, J., Zhu, L., Wang, L., Chen, Y., Giri, B. R., Li, J., Cheng, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum. J. Vis. Exp. (135), e57514, doi:10.3791/57514 (2018).

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