单缓步动物标本的超低输入基因组测序库制备
Summary
微生物基因组测序过程中的污染仍然是一个大问题。在这里, 我们展示了一种方法来序列的缓步动物的基因组从一个单一的样本, 只有 50 pg 的基因组 DNA 没有整个基因组的放大, 以减少污染的风险。
Abstract
水熊蟲是微小的动物, 进入一个 ametabolic 的状态称为 anhydrobiosis 时, 面对干燥, 可以返回到他们的原始状态, 当水供应。像水熊蟲这样的微小动物的基因组测序有可能导致细菌污染, 例如, 关于这些动物水平基因转移的程度。在这里, 我们提供了一个超低的输入方法序列的基因组的缓步动物, Hypsibius dujardini, 从一个单一的标本。通过使用严格的洗涤和污染物排除以及高效提取单个个体的 50 ~ 200 pg 基因组 DNA, 我们构建了一个用 DNA 测序仪测序的库。这些图书馆是高度重现性和无偏见的, 并对序列读取与其他H. dujardini基因组的信息学分析显示了少量的污染。此方法可应用于无法用以前的方法排序的 unculturable 水熊蟲。
Introduction
水熊蟲是微小的动物, 可以进入一个 ametabolic 的状态称为 anhydrobiosis 时, 面对干燥。他们由水的吸收1,2恢复。在 ametabolic 状态下, 水熊蟲能够耐受各种极端环境, 其中包括极端温度3和压力4,5, 高剂量的紫外线光6, X 射线和伽玛射线7,8, 宇宙空间9。基因组数据是研究 anhydrobiosis 分子机制的不可缺少的基础。
以前试图序列的水熊蟲基因组已经显示细菌污染的迹象10,11,12,13,14。基因组测序从这些小有机体需要大量的动物和容易细菌污染;因此, 我们以前已经建立了一个排序协议使用一个超低的输入方法从一个单一的缓步动物样本, 以最小化15的风险。利用这些数据, 我们进一步进行了高品质的重测序和重组dujardini16,17的基因组。在这里, 我们详细描述了这个方法的基因组测序从一个单一的缓步动物个体(图 1)。这种测序方法的验证超出了本文的重点, 在我们上一份报告16中已经作了深入的讨论。
该方法由两部分组成: 分离出具有最低污染的单一缓步动物, 以及高质量的象形文字 DNA 水平提取。缓步动物是饥饿和冲洗彻底与水, 以及抗生素, 并观察下显微镜下500X 倍放大, 以确保清除任何细菌污染。以前的估计和测量表明, 单个的缓步动物包含大约 50-200 pg 的基因组 DNA16, 这是通过裂解甲壳素外骨骼的冻融循环或手工均匀化提取。这种基因组 dna 被提交到图书馆建设和排序的 dna 测序仪。另外一项信息学分析显示, 与以前的缓步动物测序项目相比, 高质量的测序以及较低的污染水平。
Protocol
Representative Results
Discussion
细菌污染对微生物的基因组测序构成威胁。虽然以前关于缓步动物基因组测序的研究已经通过广泛的信息学方法12、20来筛选出污染, 但我们对单个个体的基因组进行了排序, 以尽量减少污染物的风险。由于单个缓步动物包含大约 50-200 pg 基因组 DNA16和包裹在厚层甲壳素外骨骼, 排除污染物和高质量的 DNA 提取是本议定书的关键点。现有的…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢 Nozomi、Takai 和 Nahoko 在基因组测序中的技术支持。这项工作得到了日本促进科学学会 (jsp) 研究员的资助, KAKENHI 为年轻科学家提供援助 (22681029 号), 以及 KAKENHI 的科研资助 (B), 来自 jsp 的17H03620 号, 由一个来自住友基金会 (140340 号) 基础科学研究项目的赠款, 部分是由山形县政府和日本鹤的研究基金提供的。以小球藻为原料, 提供水熊蟲的小球藻。
Materials
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
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