Frequenzverschiebungen Eingabe Genom Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von einem einzigen Tardigrade Exemplar
Summary
Kontamination während der Genom-Sequenzierung von mikroskopisch kleinen Organismen bleibt ein großes Problem. Hier zeigen wir eine Methode um das Genom der Bärtierchen aus einem einzigen Exemplar mit so wenig wie 50 Pg genomic DNA ohne Verstärkung des gesamten Genoms zur Minimierung des Risikos einer Kontamination zu sequenzieren.
Abstract
Bärtierchen sind mikroskopisch kleine Tiere, die einen Ametabolic Staat eingeben genannt Anhydrobiosis gegenüber Austrocknung und kann in ihren ursprünglichen Zustand zurück, wenn Wasser zugeführt wird. Die Genom-Sequenzierung von mikroskopisch kleinen Tieren wie Bärtierchen Risiken bakterielle Kontamination, die manchmal führt zu falschen Interpretationen, zum Beispiel über den Umfang der horizontalen Gentransfer bei diesen Tieren. Hier bieten wir eine Frequenzverschiebungen Eingabemethode um das Genom der Bärtierchen Hypsibius Dujardini, aus einem einzigen Exemplar zu sequenzieren. Durch den Einsatz von strengen waschen und Schadstoffbelastung Ausgrenzung sowie eine effiziente Extraktion der 50 ~ 200 Pg genomische DNA aus einer einzelnen Person, errichteten wir eine Bibliothek mit einem DNA-Sequenzierung sequenziert. Diese Bibliotheken wurden hoch reproduzierbare und unvoreingenommene und eine Informatik-Analyse des sequenzierten lautet mit anderen H. Dujardini Genome zeigte eine minimale Menge an Verunreinigungen. Diese Methode kann auf unculturable Bärtierchen angewendet werden, die mit bisherigen Methoden nicht sequenziert werden könnte.
Introduction
Bärtierchen sind mikroskopisch kleine Tiere, die einen Ametabolic Staat namens Anhydrobiosis gegenüber Austrocknung eingeben können. Sie wiederherstellen, indem Sie die Absorption von Wasser1,2. Im Ametabolic Zustand sind Bärtierchen in der Lage, verschiedene extreme Umgebungen, die auch extremen Temperaturen3 und Druck4,5, eine hohe Dosierung von UV Licht6, Röntgenstrahlen und Gammastrahlen zu dulden 7 , 8und kosmischen Raum9. Genomdaten ist eine unabdingbare Grundlage für die Erforschung der molekularen Mechanismen der Anhydrobiosis.
Frühere Versuche, das Genom der Bärtierchen sequentiell zeigten Anzeichen einer bakteriellen Kontamination10,11,12,13,14. Genom-Sequenzierung von solchen kleinen Organismen erfordert eine große Anzahl von Tieren und ist anfällig für bakterielle Kontamination; Daher haben wir vorher eine Sequenzierung-Protokoll unter Verwendung einer Frequenzverschiebungen Eingabemethode, ausgehend von einem einzigen Exemplar der Bärtierchen, zur Minimierung des Risikos von Kontaminationen15etabliert. Mithilfe dieser Daten haben wir eine qualitativ hochwertige Neuanordnung und Remontage des Genoms von H. Dujardini16,17weiter durchgeführt. Hier beschreiben wir im Detail dieser Methode für die genomische Sequenzierung von tardigrade einzelnen ()Abbildung 1). Die Validierung dieser Sequenzierung Methode ist darüber hinaus im Mittelpunkt dieses Papiers und ist bereits in unserem vorherigen Bericht16gründlich diskutiert worden.
Diese Methode besteht aus zwei Teilen: die Isolation von einem einzigen Bärtierchen mit möglichst geringen Verunreinigungen und die qualitativ hochwertige Gewinnung von Piktogramm Ebenen der DNA. Die Bärtierchen ist verhungert und gründlich mit Wasser sowie Antibiotika gespült und beobachtet unter dem Mikroskop mit 500 X Vergrößerung um die Beseitigung der bakteriellen Verunreinigungen zu gewährleisten. Frühere Schätzungen und Messungen zeigen, dass ein einzelner Bärtierchen ca. 50-200 Pg genomische DNA-16, enthält, die durch das Chitin-Exoskelett knacken, durch Frost-Tau-wechseln oder durch manuelle Homogenisierung extrahiert wird. Diese genomische DNA ist Bibliotheksbau vorgelegt und auf einem Instrument DNA-Sequenzierung sequenziert. Eine zusätzliche Informatik-Analyse zeigt qualitativ hochwertige Sequenzierung sowie geringe Mengen an Verunreinigungen im Vergleich zu früheren tardigrade Sequenzierung Projekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakterielle Kontamination stellt eine Bedrohung für die Genom-Sequenzierung von mikroskopischen Organismen. Während frühere Studien zu tardigrade Genomsequenzierung, Kontamination mit umfangreichen Informatik Methoden12,20herausgefiltert haben, sequenziert wir das Genom von einer einzelnen Person das Risiko von Kontaminationen zu minimieren. Da eine einzelne Bärtierchen enthält ungefähr 50-200 Pg genomische DNA16 und ist umhüllt von…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Nozomi Abe, Yuki Takai und Nahoko Ishii für ihre technische Unterstützung bei der Genom-Sequenzierung. Diese Arbeit wurde unterstützt von Beihilfe für die japanische Gesellschaft für Promotion of Science (JSPS) Research Fellow, KAKENHI Beihilfe für junge Wissenschaftler (No.22681029) und KAKENHI Beihilfe für wissenschaftliche Forschung (B), Nr. 17 H 03620 von JSPS, durch eine Zuschuss für grundlegende Wissenschaft Forschungsprojekte der Sumitomo Foundation (No.140340) und andererseits durch Forschungsgelder von der Regierung der Präfektur Yamagata und Tsuruoka City, Japan. Chlorella Vulgaris verwendet, um die Bärtierchen ernähren wurde mit freundlicher Genehmigung von Chlorella Industry Co. LTD. zur Verfügung gestellt.
Materials
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
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