Ultralow genoma entrada biblioteca preparação de um único espécime Tardigrade de sequenciamento
Summary
Contaminação durante o sequenciamento de genoma de organismos microscópicos continua a ser um grande problema. Aqui, nós mostramos um método para sequenciar o genoma de um Tardigrada de um único espécime com tão pouco quanto 50 pg de DNA genômico sem amplificação do genoma inteiro para minimizar o risco de contaminação.
Abstract
Tardigrades são animais microscópicos que entram em um estado de ametabólico chamado anidrobiose quando enfrenta a dessecação e pode retorna ao seu estado original, quando a água é fornecida. O sequenciamento genômico de animais microscópicos, como tardigrades riscos contaminação bacteriana que às vezes leva a interpretações errôneas, por exemplo, sobre a extensão da transferência horizontal de genes nestes animais. Aqui, nós fornecemos um método de entrada ultralow para sequenciar o genoma da Tardigrada, Hypsibius dujardini, de um único espécime. Empregando a rigorosa exclusão de lavagem e contaminantes juntamente com uma extração eficiente dos 50 ~ 200 pg DNA genômico de um único indivíduo, nós construímos uma biblioteca sequenciada com um instrumento de sequenciamento de DNA. Essas bibliotecas foram altamente reprodutível e imparcial, e uma análise informática das leituras sequenciais com outras genomas de H. dujardini mostrou uma quantidade mínima de contaminação. Esse método pode ser aplicado a tardigrades unculturable que não podem ser sequenciados usando métodos anteriores.
Introduction
Tardigrades são animais microscópicos que podem entrar em um estado de ametabólico chamado anidrobiose, quando enfrenta a dessecação. Eles recuperar pela absorção de água,1,2. No estado ametabólico, tardigrades são capazes de tolerar vários ambientes extremos, incluindo temperaturas extremas pressões e3 4,5, uma dose elevada de luz ultravioleta6, raios-x e raios gama 7 , 8e o espaço cósmico9. Dados genomic são uma base indispensável para o estudo dos mecanismos moleculares de anidrobiose.
Tentativas anteriores para sequenciar o genoma de tardigrades mostraram sinais de contaminação bacteriana10,11,12,13,14. Sequenciamento genômico de tais organismos pequenos requer um grande número de animais e é propenso a contaminação bacteriana; Portanto, temos anteriormente estabelecido um protocolo de sequenciamento, usando um método de entrada ultralow a partir de um único espécime de Tardigrada, para minimizar o risco de contaminações15. Usando esses dados, temos mais realizado uma alta qualidade resequencing e remontagem do genoma de H. dujardini16,17. Aqui descrevemos detalhadamente este método para sequenciamento genômico de um único indivíduo tardigrade (,Figura 1). A validação deste método de sequenciamento é além do foco deste trabalho e já foi exaustivamente discutida no nosso anterior relatório16.
Esse método é composto de duas partes: o isolamento de um único Tardigrada com o mais baixo possível contaminação e a extração de alta qualidade de níveis de pictograma de DNA. A Tardigrada é fome completamente enxaguada com água, bem como antibióticos e observada sob um microscópio com ampliação de 500 X para garantir a remoção de qualquer contaminação bacteriana. Medições e estimativas anteriores mostram que um único indivíduo de Tardigrada contém aproximadamente 50-200 pg de genomic DNA16, que é extraído por rachando o exoesqueleto de quitina, por ciclos de gelo-degelo ou homogeneização manual. Este DNA genômico é enviado para a construção da biblioteca e sequenciado em um instrumento de sequenciamento de DNA. Uma análise adicional informática mostra sequenciamento de alta qualidade, bem como baixos níveis de contaminação em comparação com projetos de sequenciamento tardigrade anterior.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contaminação bacteriana representa uma ameaça para o sequenciamento de genoma de organismos microscópicos. Enquanto estudos anteriores no sequenciamento do genoma tardigrade tem filtrado contaminação usando métodos de extensa informática12,20, nós sequenciou o genoma de um único indivíduo para minimizar o risco de contaminações. Desde que um indivíduo Tardigrada contém aproximadamente 50-200 pg de DNA genômico16 e é envolt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer Nozomi Abe, Yuki Takai e Nahoko Ishii seu apoio técnico no sequenciamento genômico. Este trabalho foi financiado por subsídio para a sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS) Research Fellow, KAKENHI brasileira para jovens cientistas (No.22681029) e KAKENHI brasileira de pesquisa científica (B), n º 17 H 03620 dos JSPS, por um Subsídio para projetos de pesquisa de ciência básica da Fundação Sumitomo (No.140340) e em parte por fundos de pesquisa do governo da província de Yamagata e Tsuruoka City, Japão. Chlorella vulgaris , usado para alimentar os tardigrades foi fornecido cortesia de Chlorella Industry Co. Ltd.
Materials
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
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