Summary

Génération efficace du pancréas/duodénum homéotique Protein 1+ postérieure Foregut/pancréatique progéniteurs de hPSCs dans les Cultures de l’adhérence

Published: March 27, 2019
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole détaillé afin de différencier les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) dans les protéines de boîte homéotique pancréas/duodénum 1+ (PDX1+) pour la génération des lignées du pancréas, les cellules basé sur la croissance de monocouche de type non colonie de dissocier les cellules individuelles. Cette méthode convient pour la production homogènes cellules dérivées d’hPSC, la manipulation génétique et dépistage.

Abstract

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-dérivées des cellules pancréatiques sont une source prometteuse de la cellule pour la médecine régénérative et une plate-forme pour l’étude des processus de développement humains. Réalisé par étapes de différenciation qui récapitule les processus de développement est un des principaux moyens pour générer des cellules pancréatiques y compris pancréas/duodénum homéotique protéine 1+ (PDX1+) des cellules progénitrices pancréatiques. Les protocoles classiques initient la différenciation avec petites colonies peu après le passage. Toutefois, dans l’état de colonies ou d’agrégats, les cellules sont sujettes aux hétérogénéités, qui pourraient entraver la différenciation à PDX1+ cellules. Nous présentons ici un protocole détaillé pour se différencier de hPSCs en PDX1+ cellules. Le protocole consiste en quatre étapes et initie la différenciation par ensemencement monocellules dissociées. L’induction de SOX17+ cellules de l’endoderme définitif a été suivie par l’expression des marqueurs de tube deux intestin primitif, HNF1β et HNF4α et différenciation éventuelle en PDX1+ cellules. Le présent protocole offre une manipulation facile et peut améliorer et stabiliser l’efficacité de différenciation de certaines lignées de hPSC qui ont été précédemment trouvés à se différencier de manière inefficace en lignées endodermiques ou PDX1+ cellules.

Introduction

Le pancréas se compose principalement de cellules exocrines et endocrines et son dysfonctionnement ou surcharge provoque plusieurs maladies comme la pancréatite, le diabète et le cancer du pancréas. Afin d’élucider la pathogénie de le pancreatopathy, il est nécessaire d’analyser le processus de développement et la fonction des cellules du pancréas. En outre, une alimentation de variétés de cellule stables avec qualité robuste est nécessaire pour établir la thérapie de supplémentation de cellules/tissus. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-dérivées des cellules pancréatiques sont une source prometteuse de la cellule à ces fins, et le protocole de différenciation vers les cellules du pancréas a été intensivement étudiée1,2,3, 4. Les progrès récents dans la production in vitro de cellules β pancréatiques imitent la génération des cellules β homme adulte et ces cellules voir la thérapeutique sur l’implantation dans les diabétiques modèle souris2,3. En outre, l’analyse des cellules β générés par la les cellules souches pluripotentes induites (CISP) de sain et de type 1 diabetes patients donateurs a révélé aucune différence fonctionnelle y compris quand il est sous tension5. En outre, phénotypes de la maladie ont été partiellement reproduites dans les cellules pancréatiques induites avec CISP dérivé de patient ou hPSCs hébergeant des mutations génétiques dans le même site que les patients6,7.

Pour générer des cellules pancréatiques de hPSCs, la différenciation dirigée par étapes qui récapitule les processus de développement est utilisée. Le pancréas est dérivé de la couche de l’endoderme de l’embryon précoce, qui exprime la région Y-box 17 (SOX17) de détermination du sexe et de forkhead box A2 (FOXA2)8. Se fondant sur les études sur les souris, la couche endoderme forme le tube de l’intestin primitif, qui se caractérise par l’expression du facteur nucléaire hépatocytaire 1 bêta (Hnf1β) et le facteur nucléaire hépatocytaire 4 alpha (Hnf4α). Le tube de l’intestin primitif s’allonge et se développe dans l’appareil respiratoire, digestif et des organes. Après l’allongement, la zone de l’intestin postérieur devient la région pancréatique présumée, comme marqué par l’expression de la protéine de boîte homéotique de pancréas/duodénum de facteur de transcription 1 (PDX1)8,9,10. Les parties ventrales et dorsales de le PDX1+ gut tube épaissir à bourgeons pancréatiques de forme, qui sont marqués par la co-expression de pancréas transcription factor 1 sous-unité alpha (PTF1A) et NK6 boîte homéotique 1 (NKX6.1)8,11. Cette expression marque le début morphologique de l’organogenèse du pancréas. Les cellules pancréatiques endoderme, qui sont des composants des bourgeons pancréatiques, forment un réseau tubulaire ramifié de structures épithéliales12 et finalement se différencient en cellules exocrines et endocrines, dont les cellules insulino-sécrétrices β et α-cellules qui sécrètent du glucagon. Expression de PDX1 est détectée tout d’abord à la région pancréatique présumée, qui est ensuite observée tout au long de tout le développement du pancréas et montre la localisation de cellules β et δ9,13,14. Bien que le Pdx1+ zone de cellule qui n’exprime pas Ptf1a ou Nkx6.1 se différencie dans l’antre gastrique, duodénum, biliaires extrahépatiques et certaines cellules de l’intestin au milieu d’un stade avancé du développement chez la souris9, PDX1+ les cellules sont considérés comme les ancêtres du pancréas aux premiers stades du développement chez l’homme.

Nous présentons ici un protocole détaillé pour se différencier de hPSCs en PDX1+ cellules pour la génération des lignées du pancréas. La protocole initiés différenciation par ensemencement dissocié monocellules15,16,17. Généralement, hPSCs indifférenciées sont mémorisées dans des colonies ou des agrégats de cellules en suspension ou en adhérence. En conséquence, la plupart des protocoles initient la différenciation peu après le passage. Toutefois, dans l’état de colonies ou d’agrégats, les cellules sont sujettes à des hétérogénéités spatiales et transcriptionnelle18,19,20,21,22, qui pourrait entraver la première étape de différenciation vers endoderme définitif suivie de différenciation inefficace à PDX1+ cellules. Le présent protocole peut proposer un maniement facile pour améliorer et stabiliser l’efficacité de différenciation de certaines lignées de hPSC qui ont été précédemment trouvées pour différencier inefficacement de lignées endodermiques et PDX1+ cellules23, 24 , 25.

Protocol

Expériences à l’aide de hPSCs ont été approuvées par le Comité d’éthique de la faculté de médecine et la Graduate School of Medicine, Université de Kyoto. 1. préparation des matériaux Remarque : Préparer tous les milieux et réactifs pour culture de cellules dans un milieu stérile. Échauffement de base milieux de culture à la température ambiante (RT) avant utilisation. Médium pour la différenciation est utilis…

Representative Results

HiPSCs multiplication (585A129,30) se condensent et forment une monocouche homogène (Figure 1 b) qui convient à la différenciation. HiPSCs indifférenciés (stade 0) sont dissociées et re-graines comme des cellules individuelles à faible densité (1-1. 5 x 105 cellules/cm2). Moins de 1 h, les cellules sont fixées à la plaque et commencent à montrer la partie saillante. Jour 1, les cellules sont se sont m…

Discussion

La génération de PDX1+ cellules se compose de plusieurs étapes ; par conséquent, il est essentiel de traiter les cellules au moment opportun. Parmi les mesures, l’efficacité de l’induction de l’endoderme définitif dans une large mesure affecte l’efficacité de l’induction final, éventuellement par l’interférence des autres cellules de lignée contaminantes (mésoderme et ectoderme), qui peuvent proliférer et/ou sécrètent des facteurs qui perturber la différenciation spécifique. Si la …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu en partie par le financement de la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) par l’intermédiaire de Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 et 18 K 08510) à T.T. et subvention pour les chargés de recherche de pages jsp (jsp KAKENHI Grant Number 17J07622) A.K. et l’Agence japonaise pour la recherche médicale et le développement (AMED) par le biais de ses travaux de recherche accordent « Core Center for iPS Cell Research, centre de recherche de réseau pour la réalisation de la médecine régénérative » à K.O. Les auteurs remercient Dr Peter Karagiannis pour la lecture du manuscrit.

Materials

3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine Toronto Research Chemicals K171000 CYC
4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid Santa Cruz Biotechnology SC-203303 TTNPB
50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 339652
Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] Abcam Ab76541 Anti-CDX2, × 1/1000 dilution
B-27 Supplement (50 ×) Thermo Fisher Scientific 17504-044 Serum-free supplement
BD FACSAria II Cell Sorter BD Biosciences For flow cytometry
Biomedical freezer SANYO MDF-U538 For -30 °C storing
Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber BIO-RAD 1450011 Counting slide glass
CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR Greiner bio-one 657165 For differentiation culture/6-well plate
Centrifuge TOMY AX-310 For cell culturing
Centrifuge TOMY MX-305 For RT-qPCR
CHIR99021 Axon Medchem Axon 1386
CLEAN BENCH SHOWA KAGAKU  S-1601PRV Clean bench
Corning CellBIND 6-well plate Corning 3335 For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced Corning 354230 Basement membrane matrix
Corning Synthemax II-SC Substrate Corning 3535 For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs
Cryostat Leica Leica CM1510 S For immunostaining of aggregates.
Cytofix/Cytoperm Kit Becton Dickinson 554714 Perm/Wash buffer is  Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer.
Dako pen Dako S2002 For immunostaining of aggregates
dNTP mix (10 mM) Thermo Fisher Scientific 18427-088 For RT-qPCR
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11055 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A10036 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A10040 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey Serum Merck Millipore S30 Donkey serum
D-PBS(-) without Ca or Mg Nacalai tesque 14249-95 DPBS
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer
Filter Tip, 1000 µL Watoson 124-1000S Use together with pipettes
Filter Tip, 20 µL Watoson 124-P20S Use together with pipettes
Filter Tip, 200 µL Watoson 124-P200S Use together with pipettes
Fluorescence Microscope Keyence BZ-X700 For immunostaining
Forma Steri-Cycle CO2 incubator Thermo Fisher Scientific 370A Incubator
HNF-1β Antibody (C-20) Santa Cruz Biotechnology sc-7411 Anti-HNF1β, × 1/200 dilution
HNF-4α Antibody (H-171) Santa Cruz Biotechnology sc-8987 Anti-HNF4α, × 1/200 dilution
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570 For nucleus staining, × 1/200 dilution
Human Pancreas Total RNA Ambion AM7954 For RT-qPCR
Human PDX-1/IPF1 Antibody R&D Systems AF2419 Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution
Human SOX17 Antibody R&D Systems AF1924 Anti-SOX17, × 1/200 dilution
Improved MEM Zinc Option medium Thermo Fisher Scientific 10373-017 iMEM
Incubation chamber Cosmo Bio 10DO For immunostaining of aggregates
Latex Examination Gloves Adachi
MAS coated slide glass Matsunami Glass 83-1881 For immunostaining of aggregates
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific 4346907 For RT-qPCR
Microscope Olympus CKX41N-31PHP For cell culturing
Microtube Watoson 131-515CS
Monoclonal Anti-α-Fetoprotein SIGMA A8452 Anti-AFP, × 1/200 dilution
Nanodeop 8000 Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Oligo dT FASMAC Custom made Oligo  For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT"
Paraformaldehyde, powder Nacalai tesque 26126-54 PFA, fixative, diluted in DPBS
Pharmaceutical refrigerator SANYO MPR-514 For 4 °C storing
PIPETMAN P  GILSON Pipette
Recombinant Human KGF/FGF-7 R&D Systems 251-KG KGF
Recombinant Human Noggin PeproTech 120-10C NOGGIN
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A R&D Systems 338-AC Activin A
ReverTra Ace (100 U/μL) TOYOBO TRT-101 For RT-qPCR
Rnase-Free Dnase Set (50) QIAGEN 79254 For RT-qPCR
Rneasy Mini Kit QIAGEN 74104 For RT-qPCR
RPMI 1640 with L-Gln Nacalai tesque 30264-85 RPMI 1640
Sealing Film for Real Time Takara NJ500 For RT-qPCR
Serological pipettes 10 mL Costar/Corning 4488 For cell culturing
Serological pipettes 25 mL Costar/Corning 4489 For cell culturing
Serological pipettes 5 mL Costar/Corning 4487 For cell culturing
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb Cell signaling 3579S Anti-SOX2, × 1/200 dilution
StepOnePlus Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Sucrose Nacalai tesque 30406-25 For immunostaining of aggregates
TB Green
Premix Ex Taq II 
Takara RR820B For RT-qPCR
TC20 Automated Cell Counter BIO-RAD 1450101J1 Automatic cell counter
Tissue-Tek OCT compound 4583  Sakura Finetechnical 4583 For immunostaining of aggregates
Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters Sakura Finetechnical 4566 For immunostaining of aggregates
Triton X-100 Nacalai tesque 35501-15
Trypan Blue BIO-RAD 1450021
Ultracold freezer SANYO MDF-U33V For -80 °C storing
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-038 Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Y-27632 Wako 251-00514

References

  1. D’Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  2. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  3. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  4. Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
  5. Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
  6. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  7. Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from ‘induced pluripotent stem cells’ of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
  8. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  9. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  10. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  11. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  12. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  13. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
  14. Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
  15. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
  16. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  17. Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
  18. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  19. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  20. Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
  21. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
  22. Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
  23. Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
  24. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
  25. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  26. Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
  27. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
  28. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
  29. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  30. Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
  31. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  32. Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
  33. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
  34. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  35. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  36. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
  37. Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
  38. Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).

Play Video

Cite This Article
Toyoda, T., Kimura, A., Tanaka, H., Osafune, K. Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures. J. Vis. Exp. (145), e57641, doi:10.3791/57641 (2019).

View Video