Summary

Эффективное поколения поджелудочной железы/двенадцатиперстную кишку гомеобокс белка 1+ задняя прародителями Передняя кишка/поджелудочной железы от hPSCs в культурах адгезии

Published: March 27, 2019
doi:

Summary

Здесь мы представляем подробный протокол дифференцировать человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) в поджелудочной железы/двенадцатиперстную кишку гомеобокс белка 1+ (PDX1+) клетки для поколения поджелудочной железы линий на основе роста монослоя-колонии типа отделить одиночных клеток. Этот метод подходит для производства однородных клеток hPSC производные, генетические манипуляции и скрининг.

Abstract

Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC)-производных клеток поджелудочной железы являются перспективный источник клеток для регенеративной медицины и платформу для изучения процессов человеческого развития. Шагам направлены дифференциации, резюмирует процессов развития является одним из основных способов создания клеток поджелудочной железы, включая поджелудочной железы/двенадцатиперстную кишку гомеобокс белка 1+ (PDX1+) поджелудочной железы прогениторных клеток. Обычные протоколы инициировать дифференциация с небольшими колониями вскоре после прохождения. Однако, в состоянии колоний или агрегатов, клетки подвержены неоднородностей, которые могут препятствовать дифференциации PDX1+ клеток. Здесь мы представляем подробный протокол дифференцировать hPSCs в PDX1+ клеток. Протокол состоит из четырех этапов и инициирует дифференциация по посевной диссоциированных одиночных клеток. Индукции SOX17+ окончательного эндодермы клеток последовал выражение двух примитивных кишки трубки маркеров, HNF1β и HNF4α и возможной дифференциации в PDX1+ клеток. Настоящий Протокол обеспечивает удобство в обращении и может улучшить и стабилизировать эффективность дифференциации некоторые hPSC линии, которые ранее были обнаружены неэффективно дифференцироваться в эндодермы линий или PDX1+ клеток.

Introduction

Поджелудочной железы в основном состоит из эндокринной и экзокринной клеток, и его дисфункции или перегрузка вызывает несколько заболеваний, таких как панкреатит, сахарный диабет и рак поджелудочной железы. Для выяснения патогенеза pancreatopathy, это необходимо для анализа процесса развития и функции клеток поджелудочной железы. Кроме того стабильные ячейки поставок с надежным качеством требуется учредить терапия добавок ткани клеток. Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC)-производных поджелудочной железы клетки перспективный источник клеток для этих целей, и дифференциация протокол к клеток поджелудочной железы был интенсивно изучали1,2,3, 4. Последние достижения в в пробирке генерации клеток поджелудочной железы β имитировать генерации β-клеток взрослого человека, и эти клетки шоу терапевтической эффективности после имплантации в диабетической модели мышей2,3. Кроме того анализ β-клеток, генерируется индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) здоровых и тип 1 диабет пациентов доноров показал не функциональные различия, включая когда в условиях стресса5. Кроме того болезнь фенотипов были частично воспроизведены в искусственных клеток поджелудочной железы с пациента производные iPSCs или hPSCs, укрывательство генетические мутации в том же сайте, что пациенты6,7.

Для генерации клеток поджелудочной железы от hPSCs, используется поэтапный направленного дифференцирования, которая повторяет процессы развития. Поджелудочной железы является производным из энтодермы слоя раннего эмбриона, который выражает секс определение региона Y-бокс 17 (SOX17) и forkhead ящик А2 (FOXA2)8. Основываясь на исследованиях мыши, эндодермы слой образует примитивных кишки трубка, которая характеризуется выражением гепатоцит ядерного фактора 1-бета (Hnf1β) и гепатоцит ядерного фактора 4-альфа (Hnf4α). Примитивных кишки трубка удлиняется и развивается в органов дыхания и желудочно-кишечного тракта. После удлинения, передняя задняя кишка область становится регионе предполагаемого поджелудочной железы, как отмечено выражением transcriptional фактор поджелудочной железы/двенадцатиперстную кишку гомеобокс белка 1 (PDX1)8,9,10. Спинной и брюшной части PDX1+ кишки трубы утолщаются формы поджелудочной железы почки, которые отмечены одним выражением поджелудочной железы транскрипционного фактора 1 субблок альфа (PTF1A) и НК6 гомеобокс 18,(NKX6.1)11. Это выражение началу морфологических поджелудочной железы органогенеза. Поджелудочной железы эндодермы клеток, которые являются компонентами поджелудочной железы бутоны, формируют разветвленную сеть трубчатых эпителиальных структур12 и в конечном итоге дифференцироваться в эндокринной и экзокринной клетки, в том числе секреции инсулина β-клетками и Глюкагон секретирующих α-клетки. Выражение PDX1 обнаружен первый в регионе предполагаемого поджелудочной железы, который затем наблюдается на протяжении всего развития поджелудочной железы и показывает локализации для β – и δ-клетки9,,1314. Хотя Pdx1+ область ячейки, которая не выразить Ptf1a или Nkx6.1 отличает в желудка антрального, двенадцатиперстной кишки, кишечной клетки в середине на поздней стадии развития в мышей9, PDX1 и внепеченочных желчных протоков+ клетки, считаются прародителями поджелудочной железы на ранней стадии развития в организме человека.

Здесь мы представляем подробный протокол дифференцировать hPSCs в PDX1+ клетки для поколения поджелудочной железы линий. Дифференциация инициирует протокол путем заполнения отрыве одной клетки15,16,17. Как правило недифференцированные hPSCs поддерживаются как колоний или агрегаты клеток в суспензии или адгезии. В результате большинство протоколов инициировать дифференциация вскоре после пассированый. Однако, в состоянии колоний или агрегатов, клетки подвержены пространственных и transcriptional неоднородностей18,19,20,21,22, которые могли бы воспрепятствовать Первый шаг дифференциации в окончательное энтодермы следуют неэффективных дифференциации в PDX1+ клеток. Настоящий Протокол может предложить управляемость улучшить и стабилизировать эффективность дифференциации некоторые hPSC линии, которые были ранее признаны дифференцировать неэффективно эндодермы линий и PDX1+ клеток23, 24 , 25.

Protocol

Эксперименты с использованием hPSCs были утверждены Комитетом по этике Департамента медицины и высшая школа медицины, Университет Киото. 1. Подготовка материалов Примечание: Подготовьте все средства массовой информации и реагенты для куль?…

Representative Results

Распространение hiPSCs (585A129,30) конденсируются и образуют однородную монослоя (Рисунок 1B), который подходит для дифференциации. Недифференцированные hiPSCs (Стадия 0) отделить и вновь посеяны как единичных клеток при плотностях низкой ячейки (1-1,…

Discussion

Поколение PDX1+ клетки состоит из нескольких шагов; Таким образом крайне важно для лечения клетки в соответствующее время. Среди шагов эффективности индукции окончательного энтодермы во многом влияет на окончательный индукции эффективность, возможно, помехи от других загрязняющи…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана в части финансирования от японского общества для поощрения науки (JSP) через Scientific Research (C) (JSP-страницы KAKENHI Грант Number15K09385 и 18 K 08510) т.т., и субсидий для страниц JSP научных сотрудников (JSP-страницы KAKENHI номер гранта 17J07622) а.к., и Японское агентство для медицинских исследований и развития (AMED) через его исследования «Основной центр iPS исследования клеток, исследовательский центр сети для реализации регенеративной медицины» предоставить K.O. Авторы благодарят д-р Питер Karagiannis для чтения рукопись.

Materials

3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine Toronto Research Chemicals K171000 CYC
4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid Santa Cruz Biotechnology SC-203303 TTNPB
50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 339652
Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] Abcam Ab76541 Anti-CDX2, × 1/1000 dilution
B-27 Supplement (50 ×) Thermo Fisher Scientific 17504-044 Serum-free supplement
BD FACSAria II Cell Sorter BD Biosciences For flow cytometry
Biomedical freezer SANYO MDF-U538 For -30 °C storing
Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber BIO-RAD 1450011 Counting slide glass
CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR Greiner bio-one 657165 For differentiation culture/6-well plate
Centrifuge TOMY AX-310 For cell culturing
Centrifuge TOMY MX-305 For RT-qPCR
CHIR99021 Axon Medchem Axon 1386
CLEAN BENCH SHOWA KAGAKU  S-1601PRV Clean bench
Corning CellBIND 6-well plate Corning 3335 For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced Corning 354230 Basement membrane matrix
Corning Synthemax II-SC Substrate Corning 3535 For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs
Cryostat Leica Leica CM1510 S For immunostaining of aggregates.
Cytofix/Cytoperm Kit Becton Dickinson 554714 Perm/Wash buffer is  Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer.
Dako pen Dako S2002 For immunostaining of aggregates
dNTP mix (10 mM) Thermo Fisher Scientific 18427-088 For RT-qPCR
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11055 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A10036 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A10040 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey Serum Merck Millipore S30 Donkey serum
D-PBS(-) without Ca or Mg Nacalai tesque 14249-95 DPBS
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer
Filter Tip, 1000 µL Watoson 124-1000S Use together with pipettes
Filter Tip, 20 µL Watoson 124-P20S Use together with pipettes
Filter Tip, 200 µL Watoson 124-P200S Use together with pipettes
Fluorescence Microscope Keyence BZ-X700 For immunostaining
Forma Steri-Cycle CO2 incubator Thermo Fisher Scientific 370A Incubator
HNF-1β Antibody (C-20) Santa Cruz Biotechnology sc-7411 Anti-HNF1β, × 1/200 dilution
HNF-4α Antibody (H-171) Santa Cruz Biotechnology sc-8987 Anti-HNF4α, × 1/200 dilution
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570 For nucleus staining, × 1/200 dilution
Human Pancreas Total RNA Ambion AM7954 For RT-qPCR
Human PDX-1/IPF1 Antibody R&D Systems AF2419 Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution
Human SOX17 Antibody R&D Systems AF1924 Anti-SOX17, × 1/200 dilution
Improved MEM Zinc Option medium Thermo Fisher Scientific 10373-017 iMEM
Incubation chamber Cosmo Bio 10DO For immunostaining of aggregates
Latex Examination Gloves Adachi
MAS coated slide glass Matsunami Glass 83-1881 For immunostaining of aggregates
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific 4346907 For RT-qPCR
Microscope Olympus CKX41N-31PHP For cell culturing
Microtube Watoson 131-515CS
Monoclonal Anti-α-Fetoprotein SIGMA A8452 Anti-AFP, × 1/200 dilution
Nanodeop 8000 Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Oligo dT FASMAC Custom made Oligo  For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT"
Paraformaldehyde, powder Nacalai tesque 26126-54 PFA, fixative, diluted in DPBS
Pharmaceutical refrigerator SANYO MPR-514 For 4 °C storing
PIPETMAN P  GILSON Pipette
Recombinant Human KGF/FGF-7 R&D Systems 251-KG KGF
Recombinant Human Noggin PeproTech 120-10C NOGGIN
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A R&D Systems 338-AC Activin A
ReverTra Ace (100 U/μL) TOYOBO TRT-101 For RT-qPCR
Rnase-Free Dnase Set (50) QIAGEN 79254 For RT-qPCR
Rneasy Mini Kit QIAGEN 74104 For RT-qPCR
RPMI 1640 with L-Gln Nacalai tesque 30264-85 RPMI 1640
Sealing Film for Real Time Takara NJ500 For RT-qPCR
Serological pipettes 10 mL Costar/Corning 4488 For cell culturing
Serological pipettes 25 mL Costar/Corning 4489 For cell culturing
Serological pipettes 5 mL Costar/Corning 4487 For cell culturing
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb Cell signaling 3579S Anti-SOX2, × 1/200 dilution
StepOnePlus Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Sucrose Nacalai tesque 30406-25 For immunostaining of aggregates
TB Green
Premix Ex Taq II 
Takara RR820B For RT-qPCR
TC20 Automated Cell Counter BIO-RAD 1450101J1 Automatic cell counter
Tissue-Tek OCT compound 4583  Sakura Finetechnical 4583 For immunostaining of aggregates
Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters Sakura Finetechnical 4566 For immunostaining of aggregates
Triton X-100 Nacalai tesque 35501-15
Trypan Blue BIO-RAD 1450021
Ultracold freezer SANYO MDF-U33V For -80 °C storing
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-038 Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Y-27632 Wako 251-00514

References

  1. D’Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  2. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  3. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  4. Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
  5. Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
  6. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  7. Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from ‘induced pluripotent stem cells’ of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
  8. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  9. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  10. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  11. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  12. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  13. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
  14. Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
  15. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
  16. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  17. Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
  18. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  19. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  20. Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
  21. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
  22. Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
  23. Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
  24. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
  25. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  26. Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
  27. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
  28. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
  29. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  30. Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
  31. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  32. Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
  33. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
  34. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  35. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  36. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
  37. Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
  38. Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).

Play Video

Cite This Article
Toyoda, T., Kimura, A., Tanaka, H., Osafune, K. Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures. J. Vis. Exp. (145), e57641, doi:10.3791/57641 (2019).

View Video