无珠光高音喇叭在食子胚胎中的细胞力学探测
Summary
我们提出了一个设置的光学推子耦合到光片显微镜, 它的实现, 以探测细胞力学没有珠子在戈德罗迪拉胚胎。
Abstract
形态发生需要遗传模式和机械力之间的协调, 以有力地塑造细胞和组织。因此, 了解形态发生过程的一个挑战是在胚胎发生过程中直接测量体内的细胞力和机械性能。在这里, 我们提出了一个光学推子的设置耦合到光片显微镜, 允许直接施加力量的细胞接触早期德沃菲拉胚胎, 同时成像在几个帧每秒。这种技术的优点是, 它不需要在胚胎中注入珠子, 通常用作施加光学力的中间探针。我们逐步详细介绍了设置的实现, 并提出了从实验中提取机械信息的工具。通过实时监测细胞触点的位移, 可以进行张力测量, 研究细胞触点的流变学。
Introduction
胚胎发育是一个高度可重复的过程, 在此过程中, 细胞和组织变形, 以塑造未来的动物。这种变形已被证明需要在第1,2级的细胞中主动产生部队。为了了解细胞和组织改变形状的形态发生过程, 评估所涉及的细胞的机械特性, 并测量过程3、4 中组织内的力, 是关键.上皮层, 特别是在嗜德维拉,由于其准二维和几何形状和易于操作, 已被广泛研究。
因此, 我们和其他人开发了一些技术来评估体内的上皮力学 。我们将简要概述用于上皮组织的三种主要技术。激光消融是一种广泛使用的方法, 可以揭示细胞连接点5、6、7、8或更大比例的 9、10、11处的局部机械应力通过执行破坏目标机械完整性的局部切割。切割后的开口动力学提供了关于应力先前消融的信息, 以及关于组织12、13 的流变性的信息。激光消融的一个缺点是它是侵入性的, 因为它需要局部破坏细胞皮层。因此, 只有当一个人想要保持组织的完整性时, 才能进行有限数量的消融。另一个缺点是, 消融只提供细胞接触时张力的相对估计, 因为开口速度依赖于粘性摩擦, 这通常是未知的。磁操作也已开发并用于嗜德维拉, 涉及使用铁液14 或超磁性脂质体15。它们可以提供绝对测量16,17, 但也具有侵入性, 因为它们需要在所需的位置注射探针。这可能是非常棘手的, 取决于系统, 这并不总是适合精确的注射。第三种技术, 完全非侵入性, 是力推断18, 19,20.力推断依赖于三个点 (三细胞连接点或顶点) 的机械平衡假设, 并允许通过求解逆问题来推断所有细胞触点 (可能还有所有细胞中的压力) 的张力。对于张力, 每个顶点提供两个方程 (x 和 y)。这就产生了一个大的线性方程组, 可以在某些条件下倒置, 以评估所有细胞接触的张力。虽然这种方法非常有吸引力, 因为它只需要分割图像, 没有额外的实验或设置, 但它的准确性尚未确定, 并且它只提供相对值, 除非执行绝对校准测量。
为了克服其中的一些限制, 我们在本文中引入了光推子的设置, 结合到光片显微镜, 以施加控制力在细胞规模的胚胎上皮果蝇. 光学推拿器已被用于许多生物应用, 包括单个蛋白质的测量和细胞器和细胞21的操作。在这里, 我们报告在几十个 pn 范围内的施加力, 这是小的, 但足以诱导局部变形的细胞接触, 并在体内进行机械测量。通常情况下, 我们使用细胞触点的垂直偏转, 通过对 kymographs 的分析进行监测, 以将力与变形联系起来。重要的是, 我们的设置不需要在组织中所需的位置注入珠子, 因为光学推拿器能够直接对细胞触点施加力。光推子与光片显微镜的耦合使人们能够进行快速成像 (每秒几个帧), 这对于在较短的时间尺度上进行机械分析非常明显, 并且光毒性降低, 因为照明的样本仅限于成像22的平面。
总体而言, 光学推拿器是一种非侵入性的方法, 可在体内对嗜德维拉胚胎的细胞接触施加控制力, 并提取机械信息, 如细胞接触物 23的刚度和张力、流变特性等。24、梯度或各向异性的张力23。
Protocol
Representative Results
Discussion
光学推子允许以非侵入性的方式直接在发育中的胚胎上皮中进行绝对的机械测量。从这个意义上说, 它比激光消融等其他方法具有优势, 激光消融是侵入性的, 并提供了相对的测量、需要注射的磁力或力推断, 这些方法依赖于强有力的假设, 也提供了相对的测量。
该协议包括几个关键步骤。首先, 由于物镜可能显示色差, 并且激光陷阱将物体 “向下游” 推送, 因此必须检查红外激光…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 frm 设备 grant frm DEQ20130326509、国家政府机构的支持, 为 anr-11-bsv5-0008 (至 p. f. l.) 而代理。我们感谢法国国家研究机构支持的法国生物成像基础设施 (anr-10-inbs-04-01, “未来的投资”)。我们感谢 picsl-联邦调查局基础设施的 brice detailleur 和 claude moretti 提供的技术援助。
Materials
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
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