Sondando a célula mecânica com pinça óptica de grânulo-livre no embrião da drosófila
Summary
Apresentamos uma instalação da pinça óptica acoplada a um microscópio de folha de luz e a sua aplicação a sonda mecânica de células sem grânulos no embrião da drosófila .
Abstract
Morfogênese requer a coordenação entre a padronização genética e forças mecânicas para robustamente moldar as células e tecidos. Portanto, um desafio para compreender processos morfogenéticas é diretamente medir forças celulares e propriedades mecânicas na vivo durante a embriogênese. Aqui, apresentamos uma instalação da pinça óptica acoplada a um microscópio de folha de luz, que permite aplicar diretamente as forças em contatos do celular do embrião da drosófila , enquanto imagens a uma velocidade de vários quadros por segundo. Esta técnica tem a vantagem que não exige a injeção de grânulos para o embrião, normalmente usado como sondas intermediárias no qual forças ópticas são exercidas. Nós detalhe passo a passo a execução da instalação e propor ferramentas para extrair informações mecânicas das experiências. Ao monitorar os deslocamentos de contatos do celular em tempo real, um pode executar medições de tensão e investigar a reologia dos contatos do celular.
Introduction
Desenvolvimento embrionário é um processo altamente reprodutível, durante o qual as células e os tecidos se deformam para moldar o futuro animal. Tais deformações foram mostradas para exigir a geração ativa de forças no celular nível1,2. Para compreender processos morfogenéticas, durante o qual as células e tecidos mudam a sua forma, é, portanto, chave para avaliar as propriedades mecânicas das células envolvidas e para medir as forças dentro do tecido durante o processo de3,4 . Epitelial, especialmente em Drosophila, têm sido amplamente estudados devido a sua geometria quase-2D e à sua fácil manipulação.
Um número de técnicas, portanto, foram desenvolvido por nós e outros para avaliar mecânica epitelial na vivo durante o desenvolvimento. Vamos dar uma rápida visão geral dos três principais técnicas usadas em tecidos epiteliais. Ablação a laser, um método amplamente usado, permite revelar o estresse mecânico local na célula junções5,6,7,8 ou em maior escala9,10,11 através da realização de cortes locais que interrompem a integridade mecânica do alvo. A dinâmica da abertura do corte a seguir fornece informações tanto na ablação prévia de stress e sobre a reologia do tecido12,13. Uma desvantagem da ablação a laser é que é invasivo, como exige a ruptura local do córtex celular. Daí, um só pode executar um número limitado de ablações se você quiser preservar a integridade do tecido. Outra desvantagem é que ablações só fornecem estimativas relativas da tensão em contatos de celular, desde que a velocidade de abertura depende de atrito viscoso, o que geralmente não é conhecido. Manipulação magnética também foi desenvolvida e usada em Drosophila, envolvendo o uso de Ferrofluidos14 ou lipossomas ultramagnetic15. Eles podem fornecer medições absolutas16,17, mas também são invasoras no sentido de que eles requerem a injeção de sondas no local desejado. Isto pode ser muito complicado dependendo do sistema, que não é sempre passível de injeções precisas. Uma terceira técnica, totalmente não-invasivo, é força inferência18,19,20. Força de inferência se baseia na suposição de equilíbrio mecânico em pontos triplos (fialoconídios entroncamentos ou vértices) e permite inferir as tensões em todos os celular contatos (e possivelmente, pressões em todas as células) por resolver um problema inverso. Para tensões, cada vértice fornece duas equações (X e Y). Isso resulta em um grande sistema de equações lineares que pode ser invertido sob algumas condições para avaliar a tensão em todos os contatos do celular. Enquanto este método é muito atraente, como não exige somente uma imagem segmentada e nenhuma experiência extra ou instalação, sua precisão é ainda a determinar, e novamente apenas fornece valores relativos, a menos que uma medida absoluta da calibração é executada.
Para superar algumas destas limitações, apresentamos neste artigo uma instalação da pinça óptica acoplado a um microscópio de luz folha aplicar forças controladas na escala celular no epitélio embrionário da Drosophila melanogaster. Pinça óptica têm sido utilizada para numerosas aplicações biológicas, incluindo as medições em proteínas simples e manipulação de células e organelas21. Aqui, nós relatamos as forças aplicadas na faixa de uns dúzia de pN, que é pequena, ainda suficientes para induzir deformações locais de contatos do celular e realizar medições mecânicas na vivo. Normalmente, usamos perpendicular deflexão de contatos do celular, monitorada através da análise de kymographs, para relacionar força-deformação. Importante, nossa configuração não exige a injeção de grânulos no local desejado no tecido, como Pinça óptica é capaz de exercer directamente forças nos contatos do celular. A atrelar a Pinça óptica para um microscópio de luz folha permite realizar imagens rápidas (vários quadros por segundo), que é muito sensível para uma análise mecânica em escalas de tempo curto e com reduzida fototoxicidade, desde a iluminação da amostra é limitada ao plano da imagem latente de22.
Globalmente, ópticas pinças são uma maneira não-invasiva para aplicar forças controladas em contatos do celular em in vivo, o embrião da drosófila e extrair informações mecânicas, tais como rigidez e tensão na célula contatos23, propriedades reológicas 24e gradiente ou anisotropia da tensão23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pinça óptica permite realizar medições absolutas mecânicas diretamente no epitélio embrionário em desenvolvimento de forma não-invasiva. Nesse sentido, apresenta vantagens sobre outros métodos tais como a ablação a laser, que são invasivos e fornecem medidas relativas, forças magnéticas, que requerem injeções, ou forçar a inferência, que se baseia em suposições fortes e também fornecem relativo medições.
O protocolo inclui alguns passos críticos. Em primeiro lugar, como…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por um FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (a P.-F.L.). Reconhecemos a infra-estrutura de França-BioImaging suportada pelo francês Agência Nacional de pesquisa (ANR-10-INBS-04-01, «Investimentos para o futuro»). Agradecemos a Brice Detailleur e Claude Moretti da infra-estrutura de PICSL-FBI para assistência técnica.
Materials
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
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