마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상
Summary
여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.
Abstract
포유류 피 질 흥분 성의 억제 신경, 각각 특정 electrophysiological 및 생 화 확 적인 속성, 시 냅 스 연결의 많은 종류의 구성 그리고 vivo에서 기능, 하지만 그들의 기본 기능과 해 부 조직 세포에서 네트워크 규모를 제대로 이해 하 고 있습니다. 여기 우리는 대뇌 피 질의 세포 조직의 조사에 대 한 두뇌의 큰 영역에 걸쳐 붙일 표시 된 신경 세포의 3 차원 영상에 대 한 메서드를 설명합니다. 특정 유형의 신경 형광 퇴행 성 신경 추적기의 주입 또는 유전자 변형 쥐에 형광 단백질의 식에 의해 표시 됩니다. 블록 뇌 샘플, 예, 반구, 고정 후 준비, 청소 방법, 조직으로 투명 하 게 만들 있으며 형광 immunolabeling는 특정 종류의 세포를 받게. 큰 지역 대형 작업 거리 목표 및 자동화 한 단계 또는 두 광자 공초점 현미경을 사용 하 여 검색 합니다. 이 메서드는 마우스 피 질에는 셀 형식 관련 microcolumn 기능 모듈의 주기적인 조직을 해결할 수 있습니다. 절차는 다른 복잡 한 조직과 다양 한 뇌 영역에 3 차원 세포 구조의 연구에 대 한 유용할 수 있습니다.
Introduction
포유류 피 질 세포 유형, 각각 특정 유전자 표현 패턴, electrophysiological 및 생 화 확 적인 속성, 시 냅 스 연결의 많은 수의 구성 및 기능을 vivo에서 1,2 3,,45,,67. 이러한 세포 유형 반복 구조로 구성 됩니다 여부 되었습니다 분명. 시각적인 방향 열과 somatosensory 배럴을 포함 하 여 대뇌 피 질의 열 구조, 반복 하지만 그들의 세포 조직 남아 불분명8,9. 이들은 특정 대뇌 피 질의 영역에 존재 하 고 뇌 전체 시스템을 않습니다.
Neocortical 계층 5, 뉴런의 대다수는 4 개의 주요 유형으로 분류 됩니다. 주요 유형의 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 흥분 성의 뉴런 프로젝트 폰, 척수, 및 우량한 colliculus 바꾸어 대상에 축 삭 그리고, 따라서,10주요 외피 출력 경로 나타냅니다. 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런 흥분 성의 뉴런의 다른 주요 유형10피 질 자극. 금지 신경 또한 두 개의 주요 클래스를 포함: parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 세포11.
최근 분석 나타냅니다 4 셀 유형 반복된 구조12,,1314로 구성 됩니다. 하위 대뇌 프로젝션 뉴런12,,1314 및 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런14 직경 1-2 셀의 셀 타입 특정 microcolumns로 구성. Parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 셀 정렬 하위 대뇌 프로젝션 뉴런의 microcolumns로 아니라 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런14microcolumns. Microcolumns 스스로 형태는 6 각형 격자 배열14 와 마우스 뇌12,14 와 언어 somatosensory, 시각과 모터 분야를 포함 한 여러 피 질 지역에 있는지를 주기적으로 정렬 인간의 뇌는13의 지역입니다. 개별 microcolumn에 신경 동기화 된 활동을 전시 하 고 비슷한 감각 반응이14. 이러한 관측 레이어 5 셀 유형 반복 기능 모듈의 첫 번째 알려진된 뇌 전체 조직을 나타내는 microcolumn 격자 구조로 구성 나타냅니다.
Microcolumns 약 10 µ m의 반지름을가지고 있고 약 40 µ m의 공간 주기. 또한, microcolumns의 방향을 피14에서 그들의 위치에 따라 그들의 변화와 꼭대기 dendrites 평행 하다. 따라서, microcolumn 시스템은 마이크로 미터의 몇 수만의 전형적인 두께가 기존의 대뇌 피 질의 조각을 사용 하 여 분석 하기가 어렵습니다. 또한, 주기 분석 3 차원 데이터는 다양 한 뇌 영역, 그리고, 그러므로, confocal 현미경 검사 법의 일반적인 이미징 영역에서에서 또는 vivo에서 2 광자 영상 너무 좁고입니다.
최근, 기술 두꺼운 조직15,16를 개발 되었습니다. 여기는 microcolumn 시스템을 구성 하는 주요 셀 형식 마우스 neocortical 레이어 5에서에서의 대규모, 3 차원 이미지를 얻기 위해 이러한 방법을 응용 프로그램에 설명 합니다. Subcerebral 프로젝션 뉴런 역행 표시 또는 Crym egfp 유전자 변형 쥐12, 그리고 대뇌 피 질의 프로젝션 뉴런에는 레이블로 역행에 향상 된 녹색 형광 단백질의 식으로 표시 됩니다. 라벨 또는 Tlx3–cre/Ai9 마우스17에 tdTomato 식으로. Parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 셀 immunohistochemistry에 의해 표시 됩니다. (깊은 뇌 참조) SeeDB 방법19 다른 실험 사용 된다 실험, 얼룩이 지는 항 체 (항 체 규모 S) AbScale 방법18 사용 됩니다. 이러한 방법은 기존의 이미징 방법의 위에서 언급 한 어려움을 극복 하 고 레이어 514의 정확한 세포 조직 공개.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 마우스 neocortical 레이어 5에에서 주요 세포 유형의 셀 형식 관련 조직의 대규모 3 차원 이미지를 얻기 위해 절차를 제시. 기존의 조각 얼룩에 비해, 메서드는 결정 하는 피 질의 3 차원 조직에 더 유용 합니다. 메서드를 사용 하는 더 넓은에서 이미지 수집 그리고 깊은 두뇌 지구 2 광자 현미경 전형적인 vivo에서 또는 전통적인 confocal 현미경 검사 법에 비해, 따라서 neocortical 휴대의 포괄…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 감사 미 야와 키 아츠 시와 히로시 하 마 원고, 편집에 대 한 찰스 요코야마 AbScale 실험에 그들의 조언을 에리코 Ohshima 및 그들의 기술 지원에 대 한 미유키 Kishino. 이 작품은 과학적 연구에서 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (MEXT) 일본의 남에 대 한 남 및 연구비 RIKEN에서 연구 자금에 의해 지원 되었다 (혁신적인 지역 “생체 Neurocircuitry”; 22115004)와 S.S. (25890023)입니다.
Materials
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 | |
References
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