Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme
Summary
Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.
Abstract
Memeli yeni korteksimiz eksitatör ve inhibitör nöronlar, her biri belirli elektrofizyolojik ve biyokimyasal özellikleri, sinaptik bağlantıları, birçok türde oluşmaktadır ve in vivo fonksiyonları, onların temel fonksiyonel ve anatomik Organizasyon hücresel ağ ölçek kötü anlaşılmaktadır. Burada beyin kortikal hücresel organizasyon incelenmesi için geniş alanlar arasında fluorescently etiketli nöronlar üç boyutlu görüntüleme için bir yöntem açıklanmaktadır. Nöronlar belirli türleri floresan retrograd nöronal izleyiciler enjeksiyon veya transgenik farelerde floresan proteinlerin ifade tarafından etiketlenir. Blok beyin örnekler, Örneğin, bir yarımküre fiksasyon sonra hazırlanan, yöntemleri takas doku ile şeffaf yapılmış ve belirli hücre tiplerinin floresan immunolabeling tabi. Geniş alanlarda büyük çalışma mesafe hedefler ve motorlu aşamaları ile donatılmış confocal veya iki fotonlu mikroskoplar kullanılarak taranır. Bu yöntem hücre türüne özgü microcolumn fonksiyonel modüller içinde fare yeni korteksimiz periyodik organizasyonu çözebilirsiniz. Yordamı üç boyutlu hücresel mimarisi farklı beyin bölgeleri ve diğer karmaşık doku çalışma için yararlı olabilir.
Introduction
Memeli yeni korteksimiz çok sayıda hücre tipleri, her biri belirli bir gen ifade desenleri, elektrofizyolojik ve biyokimyasal özellikleri, sinaptik bağlantıları, oluşur ve in vivo 1,2 işlevleri ,3,4,5,6,7. Bu hücre türleri tekrarlanan yapılarına olup olmadığını düzenlenir belirsiz oldu. Görsel yönü sütun ve somatosensor varil, birlikte, kortikal sütunlarını yapıları tekrarladık, ancak belirsiz8,9hücresel kuruluşlarındaki kalır. Bunlar belirli kortikal alanlarda mevcut ve beyin çapında bir sistem değildir.
Neocortical katmanında 5, nöronlar büyük çoğunluğu dört önemli türe sınıflandırılmaktadır. Eksitatör nöronlar, alt beyin projeksiyon nöronlar, büyük bir tür aksonlar subcortical hedeflerine pons, spinal kord ve üstün olacaklar gibi projeler ve bu nedenle, büyük kortikal çıkış yolu10temsil eder. Kortikal projeksiyon nöronlar, eksitatör nöronlar, başka bir ana türü korteks10innervate. İnhibitör nöronlar da iki büyük sınıflar içerir: parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri11.
Son analizler dört hücre tipleri tekrarlanan yapıları12,13,14düzenlenir gösterir. Alt beyin projeksiyon nöronlar12,13,14 ve kortikal projeksiyon nöronlar14 hücre tipi belirli microcolumns 1-2 hücreleri çapında organize etmek. Parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri özellikle alt beyin projeksiyon nöronların microcolumns ancak değil microcolumns kortikal projeksiyon nöronlar14hizalayın. Microcolumns kendilerini düzenli olarak altıgen bir dizi14 örgü ve fare beyin12,14 ve dilinde görsel, somatosensor ve motor alanları da dahil olmak üzere birden çok kortikal alanlarda mevcut formuna hizalayın. insan beyni13alanları. Bireysel microcolumn nöronlarda eşitlenmiş aktivite sergilemek ve benzer duyusal tepkiler var.14. Bu gözlemler katmanı 5 hücre tipleri fonksiyonel modüller yinelenen ilk bilinen beyin çapında organizasyonu temsil eden bir microcolumn kafes yapısına düzenlemek gösterir.
Microcolumns yaklaşık 10 µm bir yarıçap ve yaklaşık 40 µm kayma bir periodicity var. Buna ek olarak, microcolumns yönünü paralel onların apikal dendrites ve korteks14konumlarına bağlı olarak değişir. Bu nedenle, microcolumn sistem birkaç mikrometre onlarca tipik bir kalınlık ile geleneksel kortikal dilimleri kullanarak analiz etmek zordur. Ayrıca, bir çeşitli beyin bölgeleri ve bu nedenle, confocal mikroskobu tipik görüntüleme alanını üç boyutlu verileri periodicity analiz gerektirir veya vivo içinde 2-foton görüntüleme çok dardır.
Son zamanlarda, teknikleri kalın doku15,16temizlemek için geliştirilmiştir. Burada fare neocortical katmanı 5 büyük hücre tiplerinde microcolumn sistemi oluşturan büyük ölçekli, üç boyutlu görüntüleri elde etmek için bu yöntemlerin uygulanması açıklanmaktadır. Subcerebral projeksiyon nöronlar retrograd etiketleme veya Crym-egfp transgenik fareler12ve kortikal projeksiyon nöronların her iki tarafından retrograd etiketlenir gelişmiş yeşil flüoresan protein ifade etiketlenir etiketleme veya Tlx3–cre/Ai9 fareler17tdTomato ifadede. Parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri immünhistokimya tarafından etiketlenir. (Antikor ölçek S) AbScale yöntemi18 antikor (bkz: derin beyin) SeeDB yöntemi19 diğer deneyler için kullanıldığı gibi deneyler, boyama için kullanılır. Bu yöntemler konvansiyonel görüntüleme yöntemleri yukarıda belirtilen zorlukları aşmak ve katmanı 514doğru hücresel organizasyonu ortaya koyuyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz büyük hücre tiplerinin fare neocortical tabakasında 5 hücre türüne özgü organizasyonun büyük ölçekli üç boyutlu görüntü elde etmek yordamlar sundu. Geleneksel dilim boyama için karşılaştırıldığında, yöntem yeni korteksimiz üç boyutlu organizasyonu belirlemede daha yararlı olur. Yöntem resim alma üzerinden daha geniş ve daha derin beyin bölgeleri tipik vivo içinde 2-foton mikroskopi veya geleneksel confocal mikroskobu ile karşılaştırıldığında ve böylece, neocortica…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Atsushi Miyawaki ve Hiroshi Hama AbScale deneyler, Charles Yokoyama yazması, düzenleme için onların tavsiye için Eriko Ohshima ve Miyuki Kishino onların teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser için Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji (MEXT) Japonya’nın bilimsel araştırma için T.H. RIKEN araştırma fonlarından T.H. ve Grants-in-Aid tarafından desteklenmiştir (yenilikçi alanları “Mezoskopik Neurocircuitry”; 22115004) ve S.S. (25890023).
Materials
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 | |
References
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462 (2015).
- Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).
- Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be?. Frontiers in Neuroanatomy. 4, (2010).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).
- Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).
- Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).
- Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149 (4), 899-911 (2012).
- Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).
- Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kim, S. -. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
