نمو اللاهوائية وصيانة خطوط خلايا الثدييات
Summary
هنا، يمكننا وصف أسلوب جديد يتيح لزراعة اللاهوائية الطويلة الأجل من خطوط الخلايا المحددة. الوقت بقاء الحد الأقصى الذي تم اختباره 17 يوما. هذا الأسلوب مناسبة لاختبار العوامل السامة للخلايا واستكشاف الفسيولوجيا من تكرار أنوكسيكالي الخلايا.
Abstract
معظم الأسطح المخاطية جنبا إلى جنب مع نقاط المنتصف في الأورام والخلايا الجذعية المنافذ هي المناطق الجغرافية للهيئة التي وصول. تظهر الدراسات السابقة أن الاحتضان في نورموكسيك (5% CO2 في الهواء) أو التاكسج الظروف (مستويات الأوكسجين منخفض) تليها نتائج وصول حضانة (غياب الأكسجين الحرة) في صلاحية محدودة (2-3 أيام). وضعت منهجية مبتكرة تمكن زراعة خلية وصول (على الأقل 17 يوما؛ والحد الأقصى للوقت اختبار). الجانب الأكثر أهمية لهذه المنهجية ضمان أن لا الأكسجين الأخذ في النظام. وهذا يتم الحصول عليها جليحه لوسائل الإعلام، وأنابيب التفريغ والاطباق، وقوارير والماصات بأن خليط غاز اللاهوائية (ح2، وأول أكسيد الكربون2ن2) متبوعاً بالسماح للمواد اللازمة لحجته بالبيئة (غير الأكسجين) وصول قبل الاستخدام. يجب توخي الحذر إضافية عند اكتساب photomicrographs لضمان عدم احتواء ميكروجرافس حصل على القطع الأثرية. في غياب الأوكسجين، مورفولوجيا الخلايا هو تغيير كبير. تتم الإشارة إلى اثنين من مورفوتيبيس متميزة لكافة الخلايا نابعة من دون وجود عوامل هوائية. يمكن تطبيق القدرة على النمو والحفاظ على خلايا الثدييات في غياب الأكسجين في تحليل فسيولوجيا الخلية والتفاعلات أنه وصف مسارات السكروز لتطوير عقاقير السرطان رواية.
Introduction
وتوجد خلايا من الأورام الصلبة والكوات الخلايا الجذعية، وأولئك بطانة الأسطح المخاطية في البيئات التي تعاني من مستويات انخفاض الأكسجين، بما في ذلك أكسجين1،2،،من34. في الدول الفسيولوجية طبيعية، يختلف الأوكسجين إلى أبعد من ذلك لنقص أكسجين (الغياب الكامل للأوكسجين)5،6. وذكر إدراك أن الأكسجين الغلاف الجوي يؤثر سلبا على خلايا الثدييات النسخ المتماثل، ويمكن أن يكون الأمثل أن نمو الخلايا في المختبر تحت شروط استنفاد الأكسجين في أوائل السبعينات. ريختر et al. 7 أظهرت أن 1 – 3 في المائة مستويات الأوكسجين (نقص) تعزيز كفاءة الطلاء بالمقارنة مع أكسجين الغلاف الجوي (20%). تم تمديد عمر الخلايا ضعفاني البشرية أيضا في ظروف الثقافة التاكسج8.
في فيفو، تحدث الشروط التاكسج عند مخازن الأكسجين المستنفد (مثلاً، أثناء ممارسة التمرينات الرياضية)، حيث يتم تبديل إنتاج ATP في العضلات الهيكلية من التنفس الهوائي للتخمير (التنفس اللاهوائي) مع المنتج النهائي لحمض الالكتيك9. مرضية، في الأورام السرطانية، الداخلية للورم هو كتلة التاكسج لوصول بسبب ضعف الأوعية الدموية10. أثر نضح محدودة على الورم الداخلية بصورة مستقلة يقرها الداخلية الورم استعمر اللاهوائيات تلزم1. ميتشانيستيكالي، وورم الخلايا البقاء في نقص يعتقد أن تعتمد فقط على التعبير عن الجينات 1-ألفا عامل نقص إيندوسيبلي (HIF1-ألفا)، وهو استجابة عفوية الأولية لنقص4،11 , 12– HIF1-ألفا هو فعل بروتينات الصدمة الحرارية التي تربط HIF1تحت ظروف التاكسج-المروج ألفا و upregulate النسخ الجيني12. ويعتقد هذه البروتينات صدمة الحرارة للمساعدة في تنظيم دورات تعريفية لتعمل مختلف ينظر في ورم المكروية التاكسج. تعمل هذه يحمل تعبير زيادة ناقلات الجلوكوز غشاء الخلية ومعدل تحلل (تأثير واربورغ)13. والنتيجة هي التحول من الفسفرة المتقدرية لاكتات التخمير.
بقاء وصول أيضا استخدام بدائل للسكر لدعم ال14،ظاهرة بقاء15. هو أفضل مثال الثدييات درس فأر الخلد، التي يمكن البقاء على قيد الحياة لما يقرب من 20 دقيقة دون الأوكسجين من خلال مسار تخمير جليكوليتيك الفركتوز يحركها14. يحدث تكيف بديلة في بعض الأسماك (مثلاً، سمك الشبوط [Carassius sp.]، التي يمكن البقاء على قيد الحياة لفترة أطول إلى حد كبير الوقت فترات استخدام تحلل مع الإيثانول كمنتج ثانوي المحطة الطرفية)15. وفي كلتا الحالتين، محركات التخمير الأيض التمكينية البقاء على قيد الحياة في الغياب الأكسجين. الفرضية الحالية لوصول البقاء على قيد الحياة أن فترة طويلة ك HIF1–يتم تنشيط ألفا خلال نقص، التنفس المتقدرية، دون الحاجة للأوكسجين، يحدث تحت الظروف اللاهوائية16. وعلاوة على ذلك، هو افترض أن يحسن استخدام مسار معفن لبقاء التاكسج/وصول بقاء الورم نظراً لتجنب الأكسدة التي يمكن أن تكون ضارة ل بقاء الخلية17من الخلايا. ويدعم هذه الفرضية دراسة أجريت مؤخرا مما يدل على أن نقص في cardiomyocytes، يقلل من الأكسدة على خلايا الورم17.
حتى الآن، الطبيعة الأساسية لمسار معفن لبقاء الخلية الثديية وصول قد تم متأصلة في الأدب، يرجع، في جزء كبير منه، إلى عدم قدرة على خلايا الثدييات الثقافة في الغياب الكامل للأكسجين لأكثر من 3 أيام. ومع ذلك، يحدث بديل لتحلل لبقاء اللاهوائية في البكتيريا. في بعض البكتيريا، والنيتروجين أو كبريتات (من بين مركبات أخرى) يمكن اعتبارها متقبلون إلكترون المحطة الطرفية لنظام السيتوكروم أوكسيديز في الغياب الأكسجين18. ورغم حدوث تطور البكتيريا وحقيقية النواة جنبا إلى جنب منذ متباينة من سلف مشترك عالمي آخر، يقدر أن الميتوكوندريا كان توفير الطاقة للخلايا 1.542 مليون سنة قبل الأكسجين المحيطات19 . منذ الباحثين أظهرت أن الميتوكوندريا المعزولة يمكن أن تنتج ATP في غياب الأكسجين، مع نتريت كما يقبلون الإلكترون المحطة الطرفية، أنها من المعقول افتراض أن الخلايا تستطيع أن تعمل لفترات زمنية أطول من 3 أيام في حالة عدم وجود الأوكسجين 20 , 21 , 22 , 23-المنهجية المشروحة في هذه الدراسة قد أداة لنمو خلايا الثدييات اللاهوائية للعديد من خطوط الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمثل هذا الأسلوب خلايا الثدييات في المرة الأولى التي تم مثقف لفترات طويلة من الزمن في حالة عدم وجود الأوكسجين. استناداً إلى الملاحظات الحالية، وصول النمو قدرة عبر مسار غير معفن يظهر أن يكون عالمياً بين خلايا الثدييات خطوط28، حيث أدت إلى نمو اللاهوائية في اختلاف النمط ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون بمكتب بحوث جامعة الغرب الأوسط ورعاية برامج لدعمهم.
Materials
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants?. Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
