Crecimiento anaerobio y mantenimiento de líneas de células de mamífero
Summary
Aquí, describimos un nuevo método que permite el cultivo anaerobio a largo plazo de las líneas celulares establecidas. El tiempo máximo de supervivencia que fue probado es de 17 días. Este método es adecuado para las pruebas de agentes citotóxicos y explorar la fisiología de la anoxically replicación de las células.
Abstract
Más superficies de la mucosa junto con los puntos medios en tumores y nichos de células madre son las zonas geográficas del cuerpo que son anóxicas. Estudios previos muestran que la incubación en normoxic (5% CO2 en aire) o hipóxica condiciones (niveles bajos de oxígeno) seguido de un resultados de incubación anóxico (ausencia de oxígeno libre) en la viabilidad limitada (2-3 días). Se desarrolló una metodología novedosa que permite un cultivo celular anóxico (de al menos 17 días, el tiempo máximo de prueba). El aspecto más crítico de esta metodología es asegurar que no hay oxígeno se introduce en el sistema. Esto se obtiene por la desgasificación de los medios de comunicación y por lavado de tubos, platos, matraces y pipetas con una mezcla de gas anaerobio (H2, CO2, N2) seguido por permitir que los materiales a que se equilibren al ambiente anóxico (sin oxígeno) antes de su uso. Debe tener cuidado adicional al adquirir fotomicrografías a garantizar que las micrografías obtenidas no contienen artefactos. En ausencia de oxígeno, morfología de la célula se altera significativamente. Se observan dos morfotipos diferentes para todas las células cultivadas anaeróbicamente. La capacidad de crecer y mantener las células de mamíferas en ausencia de oxígeno puede aplicarse al análisis de la fisiología celular, interacciones de naturaleza polimicrobiana y la caracterización de vías biosintéticas para desarrollo de medicamentos nuevos de cáncer.
Introduction
Las células de tumores sólidos, nichos de células madre y los recubren las superficies de la mucosa existen en ambientes que experimentan niveles de reducción de oxígeno, como anoxia1,2,3,4. En Estados fisiológicos normales, oxigenación varía más allá de hipoxia anoxia (ausencia completa de oxígeno)5,6. La realización que el oxígeno atmosférico afecta la replicación de células de mamífero y ese crecimiento de la célula en vitro puede ser optimizado en condiciones de oxígeno empobrecido se reportó en la década de 1970. Richter et al. 7 demostró que 1 – 3% de los niveles de oxígeno (hipoxia) mayor eficiencia chapado en comparación con el oxígeno atmosférico (20%). La vida de la célula diploide humana se extiende también en la cultura hipóxico condiciones8.
In vivo, se producen condiciones hipóxicas cuando tiendas de oxígeno empobrecido (por ejemplo, durante el ejercicio intenso), en donde se conecta la producción de ATP en el músculo esquelético de respiración aerobia, fermentación (respiración anaerobia) con la producto final ácido láctico9. Patológico, en los tumores cancerosos, el interior del tumor masa es hipóxico a anoxia debido a la pobre vascularización10. El efecto de la perfusión limitada en interiores de tumor es validado independientemente por interiores de tumor colonizados por anaerobios obliga1. Mecánico, supervivencia de la célula del tumor en hipoxia se piensa que es únicamente dependiente de la expresión del gene de alfa 1 del factor inducible por la hipoxia (HIF1-alfa), que es la respuesta espontánea inicial a hipoxia4,11 , 12. HIF1-alfa es inducida bajo condiciones hipóxicas por proteínas de choque térmico que se unen HIF1-alfa promotor y alza la transcripción génica del12. Estas proteínas de choque térmico se creen que ayuda en la inducción de los diferentes fenotipos en el microambiente hipóxico del tumor. Estos fenotipos muestran un incremento en la expresión de los transportadores de glucosa de la membrana celular y la tasa de glucólisis (efecto Warburg)13. El resultado es un interruptor de la fosforilación oxidativa mitocondrial de lactato fermentación.
Supervivencia anóxica también puede utilizar alternativas a la glucosa para apoyar la supervivencia fenómeno14,15. El mejor ejemplo mamífero estudiado es la rata topo, que puede sobrevivir durante casi 20 minutos sin oxígeno a través de una vía basada en fructosa glucolisis fermentación del14. Una adaptación alternativa ocurre en ciertos pescados (por ejemplo, carpa [Carassius SP.], que puede sobrevivir mucho más de largo periodos de tiempo mediante glucólisis con etanol como subproducto terminal)15. En ambos casos, la fermentación impulsa el metabolismo lo que permite la supervivencia en ausencia de oxígeno. La hipótesis actual para la supervivencia poste-anóxica es que tanto tiempo como HIF1-alfa se activa durante la hipoxia, la respiración mitocondrial, sin la necesidad de oxígeno, ocurre bajo condiciones anaeróbicas16. Además, se postula que el uso de una vía fermentativa de supervivencia hipóxica/anóxica mejora supervivencia del tumor ya que las células de evitar el estrés oxidativo que podría para ser perjudicial para la supervivencia celular del17. Este postulado es apoyado por un estudio reciente que muestra que en los cardiomiocitos, la hipoxia reduce el estrés oxidativo que se colocan en el tumor de la célula17.
Hasta la fecha, la naturaleza esencial de una vía fermentativa para la supervivencia de células de mamífero anóxico ha sido inculcada en la literatura, debido, en gran parte, a la incapacidad de las células mamíferas de la cultura en la ausencia completa de oxígeno durante más de 3 días. Sin embargo, una alternativa a la glucólisis para la supervivencia anaerobia ocurre en las bacterias. En ciertas bacterias, nitrógeno o sulfato (entre otros compuestos) puede servir como aceptores de electrones terminal para el sistema de la citocromo oxidasa en ausencia de oxígeno18. Aunque la evolución de bacterias y eucariota ocurrió paralelamente desde divergentes desde el último antepasado común universal, se estima que las mitocondrias fueron proporcionando energía a las células de 1,542 millones años antes de la oxigenación de los océanos19 . Puesto que los investigadores han demostrado que la mitocondria aislada puede producir ATP en ausencia de oxígeno, con nitrito como aceptor terminal de electrones, es razonable asumir que las células podrían funcionar durante períodos de tiempo más de 3 días en ausencia de oxígeno 20 , 21 , 22 , 23. la metodología descrita en este estudio tiene una utilidad para el crecimiento de células de mamífero anaerobio de numerosas líneas celulares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método representa la primera vez de células de mamífero que fueron cultivadas durante largos períodos de tiempo en ausencia de oxígeno. Basado en observaciones actuales, el crecimiento anóxico capacidad a través de una vía no fermentante parece ser universal entre las células mamíferas líneas28, donde el crecimiento anaerobio dio lugar a la divergencia de fenotipo. Esto se observó para todas las líneas celulares probadas. Con el cultivo anaeróbico, aumentando la proporc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a la oficina de investigación de la Universidad de Midwestern y programas patrocinados por su apoyo.
Materials
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants?. Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
