Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion
Summary
We beschrijven een cel-gebaseerde test om te melden aan de HIV-1 fusion via de uitdrukking van groen fluorescent proteïne aantoonbaar door stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het kan worden gebruikt voor het testen van remmers van virale toegang (specifiek aan de fusie stap) in cel-vrij en cel-naar-cel infectie systemen.
Abstract
Deze bepaling beoogt te specifiek verslag over HIV-1 fusion via de uitdrukking van de groen fluorescente proteïne (GFP) aantoonbaar door stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Een HIV-1 verslaggever virus (HIV-1 Gag-iCre) wordt gegenereerd door het invoegen van Cre recombinase in het genoom van het HIV-1 tussen de matrix en de Eiwitmantel eiwitten van de Gag-polyprotein. Dit resulteert in een verpakking van Cre recombinase in virusdeeltjes, die vervolgens wordt vrijgegeven in een doelcel lijn stabiel uiting van een Cre recombinase-geactiveerde rode fluorescente proteïne (RFP) op GFP schakelaar cassette. In de basale staat drukt deze cassette RFP alleen. Na de levering van Cre recombinase in de doelcel, de RFP, geflankeerd door loxP sites, accijnzen, resulterend in GFP expressie. Deze test kan worden gebruikt om te testen alle remmers van virale toegang (specifiek aan de fusie stap) in cel-vrij en cel-naar-cel infectie systemen en een klasse te identificeren van de purinergic receptorantagonisten als roman remmers van HIV-1 virale membraan fusie is gebruikt.
Introduction
De behoefte aan nieuwe antiretrovirale therapieën heeft geleid tot de ontwikkeling van high-throughput schermen voor remmers van HIV-1 entry. De bepaling van de verslaggever Gag-iCre is ontwikkeld om het identificeren van remmers van het virale vermelding bij de fusie stap in een cel-naar-cel infectie systeem door het specifiek meten van virale membraan fusion met de host celmembraan1. Een test werd ontwikkeld aan het scherm voor roman remmers die specifiek in de vroege stadia van HIV-1 infectie tot aan het punt van virale membraan fusie gehandeld. Een uitdaging tot het meten van cel infectie is dat het eerste entmateriaal geïnfecteerde donor cellen en ininfected doelcellen, bevat dus nieuwe infectie meten moeilijk is te onderscheiden van de invoercellen. Het ideale systeem zou leiden tot een heteroloog gen-markering die kan worden opgewekt door de opening van een target cel infectie en is niet aanwezig in de cel van de donor. Een populaire virale inhoud mengen assay gebaseerd op een virale eiwitten-enzym fusion, BlaM-Vpr, kunnen effectief zijn, maar heeft ook beperkingen voor hoge doorvoer, cel-cel screening2. Deze bepaling impliceert een beta-lactamase (BlaM) verslaggever gen dat is gesmolten tot HIV-1 Vpr, verpakt in virionen en geleverd in de doelcellen op virale membraan fusion. Het substraat CCF2-AM is geladen in het cytoplasma van doelcellen en ondergaat een verschuiving van de fluorescentie op decollete. De CCF2-AM substraat is duur en onbetaalbaar voor high-throughput schermen kan worden. Om te onderscheiden van donor- en het doeldomein cellen, is het nodig om kleurstof-label de doelpopulaties. Tot slot, het protocol vereist verschillende incubatie en wassen stappen die belastend en duur zijn kan bij het testen van grote aantallen van verbindingen.
De bepaling van de Gag-iCre werd ontwikkeld als een oplossing voor deze problemen, om een high-throughput screening voor remmers van fusie in cel-naar-cel transmissie. Dit systeem vereist geen substraat worden geladen in cellen. De bepaling kan ook worden gebruikt voor cel-vrije studies en is aan te passen aan andere studies van de virale fusie met pseudo-getypte HIV-1 Gag-iCre virusdeeltjes. HIV Env gemedieerde cel fusion testen kunnen meten virus Env eiwit-gemedieerde celfusie, maar dit gebruik geen werkelijke virusdeeltjes evenals de bepaling van de HIV-1 Gag-iCre3,4,5. Deze bepaling kan worden gelezen met stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het is met succes gebruikt om het scherm van de FDA-bibliotheek, alsmede een kleine bibliotheek met purinergic remmers1,6. Andere onderzoekers hebben ook vastgesteld purinergic remmers in HIV-1 fusie met behulp van een aangepast en geoptimaliseerd high-throughput fusion-bepaling die de overdracht van bèta-lactamase virus-ingekapseld in het cytoplasma7,8 rapporteert .
De Gag-iCre virus is ontworpen met een vergelijkbare benadering van de Gag-iGFP virus, invoegen van Cre recombinase tussen matrix en Eiwitmantel, geflankeerd door HIV-1 protease sites9. Het enzym Cre is gemaakt als een voorloper binnen de Gag polyprotein die rijpt wanneer HIV-1 protease wordt geactiveerd binnen het ontluikende virus deeltje ingevoegd. De levering van Cre is dus afhankelijk van de levering van de inhoud van een HIV-1 protease-geactiveerde deeltje in een target cel via een virale membraan fusion proces. Twee versies van het protocol vindt u hier. De eerste maakt gebruik van een HIV-1 besmette bevolking te infecteren van doelcellen, om te bestuderen van rechtstreekse toezending van cel naar cel van HIV. De tweede versie maakt gebruik van een cel-vrij virus te bestuderen van een cel-gratis virale infectie. De cel-naar-cel transmissie test duurt 7 dagen om te voltooien vanaf de dag dat de cellen worden ontdooid, of 5 dagen als de cellen zijn al ontdooid en gepasseerd. De bepaling van de cel-vrije infectie kan worden uitgevoerd in 5 dagen als de cellen moeten worden ontdooid en 3 dagen, als de cellen worden ontdooid en gepasseerd. Instructies krijgen ook voor het genereren van een cellijn van RG (rood-met-groen) doel in de gewenste celtype (indien een bestaande RG doel cellenvariëteit niet gebruikt wordt) met behulp van een plasmide gemaakt door de Clevers Lab10. Het wordt aanbevolen dat passende bioveiligheid voorzorgsmaatregelen worden genomen met het virus en het uiten van virus cellen in deze test. Wij voeren het besmettelijke gedeelte van deze test in een BSL2 + weefselkweek faciliteit. Nadat de cellen zijn verholpen, kunnen zij worden geanalyseerd in standaard stroom cytometry en microscopie faciliteiten.
Hier beschrijven we de toepassing van deze bepaling op scherm over roman die verbindingen remmen van HIV-1 virale membraan fusion (Figuur 1). Purinergic-receptoren zijn pro-inflammatoire mediatoren. Ons laboratorium heeft aangetoond dat de niet-selectieve remmers van purinergic receptoren als remmers van HIV-1 virale membraan fusion6 fungeren. Wij melden dat het gebruik van deze test in hoge-doorvoer roman HIV-1 virale membraan fusion-remmers kan identificeren. We laten zien dat een inhibitor van de omwenteling van de purinergic klasse van receptoren een nieuwe klasse van HIV-1 virale membraan fusion remmers vertegenwoordigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
De bepaling van de Gag-iCre heeft bewezen zeer nuttig voor het screenen van drugkandidaten die de stap van de fusie van virale replicatie kunnen remmen. Bij het uitvoeren van deze test, zijn de belangrijkste stappen om een goed signaal vergelijkbaar met de meeste virale infectie testen. De eerste kritieke stap is het produceren van hoge titers van kwalitatief goede virus. Deze stap is vereist dat de 293T cellen zijn gepasseerd regelmatig (ten minste 1 x elke 48 uur), zodat ze niet overconfluent worden en klomp samen. Bov…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door subsidies NIH/NIAID AI112423 en NIH/NIGMS GM113885 naar Benjamin K. Chen en NIH/NIAID K08-AI120806 naar Talia H. Swartz. We zouden graag bedanken de Icahn School of Medicine in Mount Sinai Dean’s Stroom Cytometry CORE.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D5546 | Media for 293 Cells |
| RPMI-1640 | Sigma Aldrich | R0883 | Media for Jurkats |
| Fetal Bovine Serum Albumin | Gibco | 16140-071 | Serum for 293 Cells |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.03 | Serum for Jurkat Cells |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | Penn/Strep used in both media |
| T75 Flasks | Corning | 3073 | Used for Culture of Jurkat Cells |
| 10cm Tissue Culture Plates | Corning | 430167 | Used for Culture of 293 Cells |
| 96 Well Plates (tissue culture Treated) | Corning | 3595 | Used for fusion assay |
| Polyjet Transfection Reagent | Signagen | SL100688 | Used to transfect 293 Cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-100ML | Used in wash steps |
| Hyclone Trypsin Protease | GE Healthcare Life sciences | SH30042.01 | For Trypsinization of 293 cells |
| Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | For Nucleofection of Jurkats |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare Life sciences | 17144002 | For Nucleofection of Jurkats |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | For all tissue culture |
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | For all tissue culture and liquid handling steps |
| Millex Syringe Filter (0.45 micron) | Millipore | SLHA033 | For filtration of virus |
| BD Slip Tip Sterile syringes | BD Diagnostics | 309656 | For filtration of virus |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | 2b | for Nucleofection of Jurkats (various models available) |
| BD Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | for flow cytometry analyss of samples | |
| Tissue Culture Hood | Various models | Fortessa 2 | |
| pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE | Addgene | 32702 | Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011). |
| pCL10a1 | Novus Bio | NBP2-29542 | Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996) |
| Gag-iCre | Benjamin Chen Lab | Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016). |
References
- Esposito, A. M., et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology. 490, 6-16 (2016).
- Cavrois, M., De Noronha, C., Greene, W. C. A sensitive and specific enzyme-based assay detecting HIV-1 virion fusion in primary T lymphocytes. Nature Biotechnology. 20, 1151-1154 (2002).
- Huerta, L., Lamoyi, E., Baez-Saldana, A., Larralde, C. Human immunodeficiency virus envelope-dependent cell-cell fusion: a quantitative fluorescence cytometric assay. Cytometry. 47, 100-106 (2002).
- Sakamoto, T., et al. Establishment of an HIV cell-cell fusion assay by using two genetically modified HeLa cell lines and reporter gene. Journal of Virological Methods. 114, 159-166 (2003).
- Herschhorn, A., et al. An inducible cell-cell fusion system with integrated ability to measure the efficiency and specificity of HIV-1 entry inhibitors. PLoS One. 6, e26731 (2011).
- Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88, 11504-11515 (2014).
- Marin, M., et al. High-Throughput HIV-Cell Fusion Assay for Discovery of Virus Entry Inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 13, 155-166 (2015).
- Giroud, C., et al. Screening and Functional Profiling of Small-Molecule HIV-1 Entry and Fusion Inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 15, 53-63 (2017).
- Hubner, W., et al. Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1. Journal of Virology. 81, 12596-12607 (2007).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9, 81-83 (2011).
- Pear, W. S., et al. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90, 8392-8396 (1993).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70, 5701-5705 (1996).
- Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium Phosphate Transfection. Current Protocols in Immunology. 10, 10-13 (2001).
