Un haut débit Cre-Lox activé Membrane virale Fusion test afin d’identifier les inhibiteurs de la Fusion membranaire virale du VIH-1
Summary
Nous décrivons un essai pour signaler sur la fusion VIH-1 par l’expression de la protéine fluorescente verte détectable par microscopie à écoulement cytometry ou fluorescence cellulaire. Il peut être utilisé pour tester les inhibiteurs d’entrée virale (plus précisément à l’étape de fusion) dans les systèmes de l’infection sans cellule et cellule-cellule.
Abstract
Ce test est conçu pour rapport spécifiquement sur le VIH-1 fusion via l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) détectable par microscopie à écoulement cytometry ou de fluorescence. Un virus VIH-1 de la journaliste (VIH-1 Gag-iCre) est généré en insérant une recombinase Cre dans le génome du VIH-1 entre la matrice et les protéines de la capside de la polyprotéine Gag. Il en résulte dans un emballage de recombinase Cre en particules de virus, qui est ensuite libéré dans une cellule cible ligne exprimant de manière stable une Cre activés par recombinase rouge protéine fluorescente (DP) à cassette de commutateur GFP. À l’état basal, cette cassette exprime DP uniquement. Suite à la livraison de la recombinase Cre dans la cellule cible, la DP, flanquée de sites loxP, accises, aboutissant à l’expression de la GFP. Ce test peut être utilisé pour tester les inhibiteurs d’entrée virale (plus précisément à l’étape de fusion) dans les systèmes de l’infection sans cellule et cellule-cellule et a été utilisé pour identifier une classe des antagonistes des récepteurs purinergiques comme nouveaux inhibiteurs de la fusion de la membrane virale VIH-1.
Introduction
La nécessité de nouveaux antirétroviraux a incité le développement d’écrans de haut débit pour les inhibiteurs d’entrée du VIH-1. Le dosage de journaliste Gag-iCre est élaboré pour identifier les inhibiteurs d’entrée virale à l’étape de fusion dans un système de cellule à cellule infection en mesurant précisément fusion membrane virale avec la membrane de la cellule hôte1. Un essai a été développé pour dépister les nouveaux inhibiteurs qui ont agi spécifiquement aux premiers stades de l’infection à VIH-1 jusqu’au point de fusion membranaire virale. Un défi à l’infection de cellule-cellule de mesure est que l’inoculum initial contienne des cellules du donneur contaminé et cible ininfected, mesure nouvelle infection est donc difficile de distinguer des cellules d’entrée. Le système idéal impliquerait un gène hétérologue marqueur qui peut être induit par l’ouverture d’une infection de cellule cible et n’est pas présent dans la cellule du donneur. Un contenu viral populaire mêlant analyse basée sur un mélange de protéines-enzyme virale, BlaM-Vpr, peut s’avérer efficace, mais a ses limites pour un débit élevé, cellules de dépistage2. Ce test implique un gène rapporteur de bêta-lactamase (BlaM) qui est fusionné à Vpr du VIH-1, empaqueté dans des virions et livré dans les cellules cibles sur la fusion membranaire virale. Le substrat CCF2-AM est chargé dans le cytoplasme des cellules cibles et subit un changement de fluorescence par clivage. Le substrat CCF2-AM est coûteux et peut être prohibitif pour les écrans de haut débit. Afin de distinguer les cellules de donneur et la cible, il est nécessaire de colorant-étiquette les populations ciblées. Enfin, le protocole nécessite plusieurs étapes de lavage et d’incubation qui peuvent être fastidieux et coûteux lorsque vous testez un grand nombre de composés.
Le dosage de Gag-iCre a été développé comme une solution à ces problèmes, à développer un dépistage des inhibiteurs de la fusion de cellule à cellule transmission haut débit. Ce système ne nécessite pas de substrat doit être chargé dans les cellules. Le test peut également être utilisé pour les études acellulaire et est adaptable à d’autres études de fusion virale utilisant des particules de virus VIH-1 Gag-iCre Pseudo-aléatoire typés. Fusion des essais VIH Env médiée par cellules peuvent de mesurer le fusion virus Env induite par la protéine cellulaire, mais ceux-ci n’utilisent pas de particules virales réelles comme le test de VIH-1 Gag-iCre3,4,5. Ce dosage peut être lu avec la microscopie écoulement cytometry ou de fluorescence. Il a été utilisé avec succès à l’écran de la bibliothèque de la FDA, mais aussi une petite bibliothèque de purinergiques inhibiteurs1,6. Autres chercheurs ont également identifié purinergiques inhibiteurs de fusion du VIH-1 à l’aide d’un test de fusion haut débit adaptée et optimisée qui signale le transfert de bêta-lactamase virus encapsulé dans le cytoplasme7,8 .
Le virus de Gag-iCre a été conçu avec une approche similaire au virus Gag-iGFP, insérant une recombinase Cre entre la matrice et de la capside, flanqué de HIV-1 protéase sites9. L’enzyme de la Cre est fait comme un précurseur inséré au sein de la polyprotéine Gag qui mûrit en activant la protéase du VIH-1 dans la particule virale naissante. La livraison de la Cre est donc tributaire de la livraison du contenu d’une particule de HIV-1 protéase activée dans une cible cellulaire via un processus de fusion des membranes virales. Deux versions du protocole sont fournies ici. Le premier utilise une population infectés par le VIH-1 pour infecter les cellules cibles, afin d’étudier la transmission directe de cellule à cellule du VIH. La deuxième version utilise un virus acellulaire pour étudier une virose acellulaire. Le test de cellule à cellule transmission prend 7 jours au complet de la journée, que les cellules sont décongelés, ou 5 jours si les cellules sont déjà décongelés et repiquées. Le test d’infection acellulaire peut être réalisé en 5 jours si les cellules doivent être décongelés et 3 jours si les cellules sont décongelés et repiquées. Instructions sont également fournies pour produire une lignée de cellules de cible (rouge-à-vert) RG dans le type de cellule désiré (si une lignée de cellules de cible RG préexistante n’est pas utilisée) à l’aide d’un plasmide, créé par le laboratoire Clevers10. Il est recommandé que mesures de biosécurité appropriées sont prises avec le virus et les cellules exprimant le virus dans ce test. Nous effectuons la partie infectieuse de ce test dans une installation de culture de tissus BSL2 +. Après que les cellules sont fixées, elles peuvent être analysées dans les installations de microscopie et cytométrie en flux standard.
Nous décrivons ici l’application de ce test à l’écran pour roman composés qui inhibent la fusion de la membrane virale du VIH-1 (Figure 1). Récepteurs purinergiques sont des médiateurs pro-inflammatoires. Notre laboratoire a démontré que les inhibiteurs non sélectifs des récepteurs purinergiques agissent comme inhibiteurs du VIH-1 membrane virale fusion6. Les auteurs rapportent que l’utilisation de ce test à un débit élevé peut identifier de nouveaux inhibiteurs de fusion membrane virale du VIH-1. Nous démontrons qu’un inhibiteur de classe des récepteurs purinergiques représente une nouvelle classe d’inhibiteurs de fusion membrane virale du VIH-1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le dosage de Gag-iCre s’est avéré pour être très utile pour le dépistage des candidats-médicaments qui peuvent inhiber l’étape de fusion de réplication virale. Lorsque vous effectuez ce test, les étapes les plus importantes pour obtenir un bon signal sont semblables à des essais d’infection virales plus. La première étape essentielle est la production des titres élevés de virus de bonne qualité. Cette étape nécessite que les cellules 293 t sont repiquées fréquemment (au moins 1 x tous les 48 h), …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par des subventions AI112423 NIH/NIAID et NIH/NIGM GM113885 à Benjamin K. Chen et NIH/NIAID K08-AI120806 à Talia H. Swartz. Nous tenons à remercier l’école de médecine de l’Icahn à du Mount Sinai doyen flow Cytometry CORE.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D5546 | Media for 293 Cells |
| RPMI-1640 | Sigma Aldrich | R0883 | Media for Jurkats |
| Fetal Bovine Serum Albumin | Gibco | 16140-071 | Serum for 293 Cells |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.03 | Serum for Jurkat Cells |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | Penn/Strep used in both media |
| T75 Flasks | Corning | 3073 | Used for Culture of Jurkat Cells |
| 10cm Tissue Culture Plates | Corning | 430167 | Used for Culture of 293 Cells |
| 96 Well Plates (tissue culture Treated) | Corning | 3595 | Used for fusion assay |
| Polyjet Transfection Reagent | Signagen | SL100688 | Used to transfect 293 Cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-100ML | Used in wash steps |
| Hyclone Trypsin Protease | GE Healthcare Life sciences | SH30042.01 | For Trypsinization of 293 cells |
| Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | For Nucleofection of Jurkats |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare Life sciences | 17144002 | For Nucleofection of Jurkats |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | For all tissue culture |
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | For all tissue culture and liquid handling steps |
| Millex Syringe Filter (0.45 micron) | Millipore | SLHA033 | For filtration of virus |
| BD Slip Tip Sterile syringes | BD Diagnostics | 309656 | For filtration of virus |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | 2b | for Nucleofection of Jurkats (various models available) |
| BD Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | for flow cytometry analyss of samples | |
| Tissue Culture Hood | Various models | Fortessa 2 | |
| pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE | Addgene | 32702 | Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011). |
| pCL10a1 | Novus Bio | NBP2-29542 | Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996) |
| Gag-iCre | Benjamin Chen Lab | Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016). |
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