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生物学

Necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 특성

Published: August 07, 2018
doi:
10.3791/58088
, , , ,
1Department of Structural Biology,St. Jude Children’s Research Hospital, 2Department of Chemical Biology and Therapeutics,St. Jude Children’s Research Hospital, 3Department of Immunology,St. Jude Children’s Research Hospital

Summary

우리는 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 및 NMR 기반 지질 바인딩 전통과 confocal 라이브 셀 현미경 이미징를 포함 하는 necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 방법 보고.

Abstract

Necroptosis는 단백질 키 니 아 제 3 (RIPK3), phosphorylates 및 혼합된 계보 니 같은 도메인 pseudokinase, MLKL, 파열 또는 permeabilize 원형질 막 활성화는 상호 작용 하는 수용 체의 활성화에 의해 트리거되는 프로그램된 한 세포 죽음 통로 . Necroptosis 면역, 감염 및 심장 혈관 질환, 뇌졸중, neurodegeneration, 그리고 암 등 여러 병 리와 관련 된 염증 통로 이다. 여기, 우리는 necroptosis에 플라즈마 막 파열의 사형 집행으로 MLKL 특성을 사용할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 우리 전통과 공초점 형광 현미경 검사 법, 함께 라이브 셀 이미징 사용 하 여 셀에 함께 계시는 플라즈마는 cytosol에서 MLKL의 재배포 전자 현미경을 사용 하 여 고정된 셀에 necroptosis의 과정을 시각화 원형질 막에 큰 구멍의 유도 전에 막. 핵 자기 공명 (NMR) 분석 생체 외에서 지질을 사용 하 여 necroptosis MLKL 중재의 putative 변조기를 식별 하는 선물이. 이 방법에 따라, 우리 됨으로 양적 지질 바인딩 환경과 phosphatidyl-이노 시 톨 인산 염 (PIPs) MLKL의 원형질 막 지정 하 고 necroptosis에 permeabilization에 필요한 중요 한 바인더.

Introduction

Necroptosis의 유전자 구성 요소를 식별 생리학과 질병1,2,3,,45necroptosis의 의미를 테스트 동물 모델의 사용을 촉진 했다. 녹아웃 쥐에 RIPK3 또는 MLKL의 제안 하는 necroptosis는 생활3,6에 대 한 필수적인 개발 및 성인 항상성에서 최소한의 의미를 했다. 또한, 특정 종 동물7,8necroptosis의 비 본질적인 역할을 지 원하는 RIPK3 또는 MLKL 유전자를 포함 하지 않습니다. 다른 한편으로, 염증, 타고 난 면제 및 바이러스 감염9,10, necroptosis의 중요 한 역할을 계시 했다 다양 한 병 리 실험실에서 유도 된 녹아웃 동물 모델 도전 11 , 12.

Necroptosis는 여러 가지 방법으로 다른 타고 난 면역 센서를 통해 신호에 의해 활성화 될 수 있다 RIPK31,,1314의 활성화에 결과의 모든. Active RIPK3에서 phosphorylates 및 MLKL3,,45,6,7,,89,10 를 활성화 11,12,13,14,15,,1617,18. 가장 공부 하 고 아마도 가장 복잡 한 방법, RIPK3의 활성화로 이어지는 죽음 수용 체 결 찰, 분기는 apoptosis 또는 necroptosis1을 유도 하거나 신호 복합물의 다운스트림 구성에 따라 포함 됩니다. Necroptosis 때 RIPK1를 통해 신호 선호 RIPK319,20의 교전에서 결과 인가요. 이 결과 쉽게 약리 억제 또는 caspase 8, 베이에서 necroptosis을 유지 하는 necroptosis의 상 상속 생 억제제의 유전 삭제 시 선호 합니다. RIPK1을 하 고 RIPK3를 활성화 합니다. 또 다른 방법은 necroptosis 활성화 하입니다 수용 체 통행세 같이 TLR3/TLR4 신호, 종사 하 고 유도 하는 어댑터 인터페론-β (TRIF) 사격 도메인 포함21를 통해 RIPK3를 활성화. 아직 necroptosis에 의해 죽고 또 다른 방법은 DNA 센서 다이, 직접 종사 하 고 활성화 하는 RIPK322의 활성화입니다.

MLKL는 N 맨끝 나선 번들 (NB) 도메인 및 규제 중괄호 지역3로 연결 단자 pseudokinase 도메인 (psKD)의 구성 cytosolic 단백질 이다. 정상 세포에서 MLKL RIPK314와 비활성 복잡 한에 생각 된다 cytosol에서 발견 된다. Necroptosis의 활성화는 psKD, 그리고 주의 중괄호3,,1523에 잠재적으로 추가 사이트의 활성화 루프에서 MLKL의 RIPK3 인 산화를 트리거합니다. 인 산화 MLKL RIPK314에서 분리 결과에 구조적 변화를 유도 합니다. 불완전 하 게 이해 구조적 변화 psKD24에서 중괄호를 놓습니다. 2 나선 포함, 중괄호, oligomerization MLKL의 C-터미널 나선25통해 putative 삼합체에 중재. 중괄호의 N 맨끝 나선 막 permeabilization24,26필수적 이다 NB 도메인 억제. 격리, NB 도메인은 원형질 막 permeabilization와 necroptosis16,,2427유도 충분 합니다. NB의 프로 necroptotic 활동은 마우스 미 발달 섬유 아 세포 MLKL (mlkl-/- MEFs)의 결핍에서 재구성 된다. NB는 우선적으로 종사 하는 인지질 phosphatidylinositol 4, 5 diphosphate (핍2) 지질 바인딩 도메인입니다. 우리는 어떤 점에서 중괄호 oligomerization 핍2 북극 머리 그룹24NB의 약한 상호 작용을 통해 플라즈마 막에 MLKL의 모집을 용이 하 게 MLKL의 활성화의 stepwise 메커니즘을 제안 했다. 막에서 주의 핍2는 중괄호 비활성 MLKL에 의해 마스크에 대 한 추가 높은 친 화력 바인딩 사이트의 규제 노출을 겪 습. 이러한 이벤트의 분자 메커니즘 해명 하지는 있지만 전반적으로, 핍2 NB의 여러 상호 작용 원형질 막의 파열으로 이어지는 불안정.

여기 우리 necroptosis24의 사형 집행으로 MLKL의 기능을 특성화 하는 데 사용 하는 특정 방법을 설명 합니다. 특히, 우리는 MLKL, NB (NBB), 중괄호는 중괄호 억제에 의해 규제 및 적용된 이합체 화 유도 플라즈마 막 파열 및 necroptosis를 통해 활성화 될 수 있다의 가장 최소한의 도메인에 초점. 우리는 우리의 유도할 수 있는 식 시스템 적용된 약물 유발 FKBP 중재 이합체 화 라이브 셀 이미징, 및 necroptosis를 받고 세포의 전자 현미경과 함께 설명 합니다. 또한, 우리 우리의 생체 외에서 NMR 분석을 phosphatidylinositols (PIPs)와 NBB의 상호 작용을 보여 줍니다.

Protocol

1. 복제 및 셀 라인 생성 PCR 증폭 NBB 지역 해당 아미노산 잔류물 1-140 (NBB140), 인간 MLKL cDNA에서에 대 한 프레임 표준 제한 효소 기반 복제 oligomerization 도메인 2 x FK506 의무적인 단백질 (2xFKBP 또는 2xFV)와 금성 형광에 하 단백질에 Doxycycline (Dox)-NBB140를 유도할 수 있는 retroviral 벡터 pRetroX-TRE3G-2xFV-금성 (표 1, 그림 1A-B). 기본 mlkl또는 ripk3-/- mlkl<…

Representative Results

라이브 셀에서 레 귤 레이트 된 necroptosis 실행 시각화 하는 최소한의 잘린된 MLKL 구문, NBB140의 유도할 수 있는 표현을 통해 가능 했습니다-2xFV-금성. 이 구조 원형질 막 permeabilization 유도 하는 기능을 유지 하 고 FKBP 카세트 (2xFV)의 oligomerization Dim 유도 통해 활성화 됩니다. 우리는 관찰 하 고 라이브 셀 현미경 이미징, 모니터링 운동 (5 분 마다) 셀 스며들 지 않는 녹색…

Discussion

우리는 우리가 MLKL 플라즈마 막 파열24의 putative 사형 집행으로 연루 결합 기술에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. MLKL이 중재 necroptosis 규제 규제 네트워크 해독, 뿐만 아니라 이러한 기술은 사용할 수 있습니다 하지 독립적으로 다른 적당 한 생물 학적 시스템의 특성. 실질적으로 말하자면, 이러한 기술은 매체-낮은 처리량 검색 도구입니다.

우리는 정기적으로…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

없음입니다.

Materials

Cloning and cell line generation
pRetroX-TRE3G Clontech 631188
Tet-On transactivator plasmid Llambi et al., 2016
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- Dillon et al., 2014
Blasticidin S Hydrochloride Thermo Fisher Scientific BP2647100 CAS#3513-03-9
Cell death quantification and live-cell microscopy
Doxycycline Clontech 631311 CAS# 24390-14-5
B/B Homodimerizer AP20187 Takara 635059 CAS# 195514-80-8
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific S7020
Syto16 Thermo Fisher Scientific S7578
NMR
15N Ammonium Chloride Cambridge Isotope Laboratories NLM-467-10 CAS# 12125-02-9
Deuterated DTT Cambridge Isotope Laboratories DLM-2622-1
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 617385-1 CAS# 7789-20-0
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside Anatrace D310 CAS# 69227-93-6
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) Avanti Polar Lipids 840046X CAS# 383907-42-4
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) Avanti Polar Lipids 850143 CAS# 849412-67-5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) Avanti Polar Lipids 850149 CAS# 799268-53-4
Specialized Equipment
IncuCyte FLR or ZOOM Essen BioScience, Inc. Live-cell microscopy imaging
Helios NanoLab 660 DualBeam  Thermo Fisher Scientific Electron microscope
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) Essen BioScience, Inc. http://www.essenbioscience.com Imaging analysis
FEI MAPS Thermo Fisher Scientific https://www.fei.com/software/maps/ EM analysis
TopSpin v3.2 Bruker BioSpin http://www.bruker.com NMR data collection
CARA v1.9.1.7 http://cara.nmr.ch/  NMR data analysis
Slidebook 3i (Intelligent Imaging Innovations) https://www.intelligent-imaging.com/slidebook Confocal microscopy
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References

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MLKLNecroptosisPlasma Membrane RuptureLive-cell ImagingNuclear Magnetic ResonanceLipid BindingMembrane TranslocationPermeabilizationMouse Embryonic FibroblastsDoxycyclineFK506-binding Protein DimerizerFluorescence MicroscopyCell Death Quantification

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McNamara, D. E., Quarato, G., Guy, C. S., Green, D. R., Moldoveanu, T. Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis. J. Vis. Exp. (138), e58088, doi:10.3791/58088 (2018).
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