Характеристика MLKL-опосредованной плазматической мембраны разрыв в Necroptosis
Summary
Мы приводим методы для характеризации MLKL-опосредованной плазматической мембраны разрыв в necroptosis, включая обычные и конфокальная микроскопия клеток изображений, сканирующей электронной микроскопии и привязки на основе ЯМР липидов.
Abstract
Necroptosis это путь запрограммированной клеточной смерти вызваны активации рецептора, взаимодействующих киназу 3 (RIPK3), которая фосфорилирует и активирует смешанной родословной киназы как домен pseudokinase, MLKL, разрыв или разрушения плазматической мембраны . Necroptosis это воспалительные путь, связанный с несколькими патологий, включая аутоиммунные заболевания, инфекционные и сердечно-сосудистых заболеваний, инсульта, нейродегенеративные и рак. Здесь мы описываем протоколы, которые могут использоваться для характеристики MLKL как палач разрыв мембраны плазмы в necroptosis. Мы визуализировать процесс necroptosis в клеток с использованием клеток изображений с обычными и конфокальный флуоресцентной микроскопии и фиксированных ячеек с помощью электронной микроскопии, которые вместе показали перераспределения MLKL от цитозоль для плазмы мембрана до индукции больших отверстий в плазматической мембраны. Мы представляем в vitro ядерного магнитного резонанса (ЯМР) анализ с использованием липиды для выявления предполагаемых модуляторы MLKL-опосредованной necroptosis. На основе этого метода, мы определили как важнейших связующих MLKL, которые требуются для ориентации плазматической мембраны и permeabilization в necroptosis количественные липидов привязки предпочтений и фосфатидилхолин инозитол фосфаты (PIPs).
Introduction
Определение генетических компонентов necroptosis способствовало использование животных моделей для проверки причастности necroptosis в физиологии и болезни1,2,3,4,5. Нокаут RIPK3 или MLKL в мышах имеет минимальные последствия развития и взрослого гомеостаза, предполагая, что necroptosis не имеет важное значение для жизни3,6. Кроме того некоторые виды не содержат RIPK3 или MLKL генов, поддерживая роль неосновных necroptosis в животных,7,8. С другой стороны сложные нокаут животных моделей с различными патологиями, индуцированной в лаборатории показали важную роль necroptosis в воспаление и врожденный иммунитет, вирусные инфекции9,10, 11 , 12.
Necroptosis может быть активирован несколькими способами передачи сигналов через различные врожденного иммунитета датчики, все из которых приводят к активации RIPK31,,1314. Активные RIPK3 в свою очередь фосфорилирует и активирует MLKL3,4,5,6,,78,9,10 ,11,12,13,14,,1516,17,18. Наиболее изучены, и возможно наиболее сложные пути, ведущие к активации RIPK3 включает смерть рецептор перевязки, который может разветвлять каждой присваивать по течению состав тонального комплексов либо навести apoptosis или necroptosis1. Necroptosis наступает при сигнализации через RIPK1 благоприятствования и результаты участия RIPK319,20. Этот результат легко благоприятствования по фармакологическим ингибирования или генетических удаления caspase 8, предполагаемый эндогенных ингибиторов necroptosis, которая держит в страхе necroptosis. RIPK1 связывается и активирует RIPK3. Еще один способ, чтобы активировать necroptosis — через Толл подобные рецепторы TLR3/TLR4 сигнализации, который привлекает и активирует RIPK3 через МДП домен содержащих вызывая адаптер-интерферона β (TRIF)21. Еще еще один способ умереть от necroptosis является активация ДНК датчика DAI, который непосредственно занимается и активирует RIPK322.
MLKL — цитозольной белок состоит из N-терминальный спирали расслоение (NB) домена и домен pseudokinase C-терминал (psKD) соединены регулирования Брейс область3. В нормальных клетках MLKL находится в цитозоле, где он считается неактивного комплекса с RIPK314. Активация necroptosis вызывает фосфорилирование RIPK3 MLKL в петле активации psKD, и потенциально дополнительные сайты в NB и фигурная скобка3,15,23. Фосфорилирование вызывает конформационные изменения в MLKL, что приводит к диссоциации от RIPK314. Плохо понимали конформационные изменения версии скобу с psKD24. Брейс, которая содержит 2 спиралей, посредником олигомеризации MLKL в предполагаемый тример через C-терминала спирали25. N-терминальный спирали скобу подавляет NB домен, который имеет важное значение для мембраны permeabilization24,26. В изоляции NB домен достаточно, чтобы побудить плазматической мембраны permeabilization и necroptosis16,24,27. Про necroptotic активность NB была воссоздана в мыши эмбриональных фибробластов в MLKL (mlkl– / – MEFs). NB — это домен привязки липидов, что преимущественно занимается дифосфат фосфатидилинозитол 4,5 фосфолипидов (пункт2). Мы предложили поэтапного механизм активации MLKL, в котором Брейс олигомеризации облегчает набор MLKL к плазматической мембране через слабого взаимодействия NB с PIP2 полярные начальник группы24. В мембраны NB подвергается регулируемого воздействия дополнительного высокоспецифичные связывающие сайта для пункта2, который замаскированы скобу в неактивных MLKL. В целом несколько взаимодействий NB с PIP2 дестабилизировать плазматической мембраны, ведущих к ее разрыву, хотя молекулярный механизм этих событий не выяснены.
Здесь мы иллюстрируем конкретные методы, используемые для описания функции MLKL как палач necroptosis24. В частности мы сосредоточены на самых минимальных домен MLKL, NB и фигурной скобкой (НББ), который регулируется Брейс торможение и может быть активировано через насильственных димеризации побудить плазмы плодного и necroptosis. Мы описываем наши системы индуцибельной выражение в сочетании с насильственных наркотиков индуцированной FKBP-опосредованной димеризации для клеток и электронной микроскопии клетки проходят necroptosis. Кроме того мы показываем наши в vitro ЯМР анализ взаимодействия Нацбанка с phosphatidylinositols (PIPs).
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы предоставляем протоколы для методов, которые мы объединили причастны MLKL как предполагаемый палач плазматической мембраны разрыв24. В дополнение к расшифровке регулирования сети, которая регулирует MLKL-опосредованной necroptosis, эти методы может использоваться самостоятель…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Нет.
Materials
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
- Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
- Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
- Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
- Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
- Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
- Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
- Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
- Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
- Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
- Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
- Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
- Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
- Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
- Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
- Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
- Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
- Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
- Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
- Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
- Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
- Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586 (2011).
- Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
- Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
- Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
- Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).
