Мы приводим методы для характеризации MLKL-опосредованной плазматической мембраны разрыв в necroptosis, включая обычные и конфокальная микроскопия клеток изображений, сканирующей электронной микроскопии и привязки на основе ЯМР липидов.
Necroptosis это путь запрограммированной клеточной смерти вызваны активации рецептора, взаимодействующих киназу 3 (RIPK3), которая фосфорилирует и активирует смешанной родословной киназы как домен pseudokinase, MLKL, разрыв или разрушения плазматической мембраны . Necroptosis это воспалительные путь, связанный с несколькими патологий, включая аутоиммунные заболевания, инфекционные и сердечно-сосудистых заболеваний, инсульта, нейродегенеративные и рак. Здесь мы описываем протоколы, которые могут использоваться для характеристики MLKL как палач разрыв мембраны плазмы в necroptosis. Мы визуализировать процесс necroptosis в клеток с использованием клеток изображений с обычными и конфокальный флуоресцентной микроскопии и фиксированных ячеек с помощью электронной микроскопии, которые вместе показали перераспределения MLKL от цитозоль для плазмы мембрана до индукции больших отверстий в плазматической мембраны. Мы представляем в vitro ядерного магнитного резонанса (ЯМР) анализ с использованием липиды для выявления предполагаемых модуляторы MLKL-опосредованной necroptosis. На основе этого метода, мы определили как важнейших связующих MLKL, которые требуются для ориентации плазматической мембраны и permeabilization в necroptosis количественные липидов привязки предпочтений и фосфатидилхолин инозитол фосфаты (PIPs).
Определение генетических компонентов necroptosis способствовало использование животных моделей для проверки причастности necroptosis в физиологии и болезни1,2,3,4,5. Нокаут RIPK3 или MLKL в мышах имеет минимальные последствия развития и взрослого гомеостаза, предполагая, что necroptosis не имеет важное значение для жизни3,6. Кроме того некоторые виды не содержат RIPK3 или MLKL генов, поддерживая роль неосновных necroptosis в животных,7,8. С другой стороны сложные нокаут животных моделей с различными патологиями, индуцированной в лаборатории показали важную роль necroptosis в воспаление и врожденный иммунитет, вирусные инфекции9,10, 11 , 12.
Necroptosis может быть активирован несколькими способами передачи сигналов через различные врожденного иммунитета датчики, все из которых приводят к активации RIPK31,,1314. Активные RIPK3 в свою очередь фосфорилирует и активирует MLKL3,4,5,6,,78,9,10 ,11,12,13,14,,1516,17,18. Наиболее изучены, и возможно наиболее сложные пути, ведущие к активации RIPK3 включает смерть рецептор перевязки, который может разветвлять каждой присваивать по течению состав тонального комплексов либо навести apoptosis или necroptosis1. Necroptosis наступает при сигнализации через RIPK1 благоприятствования и результаты участия RIPK319,20. Этот результат легко благоприятствования по фармакологическим ингибирования или генетических удаления caspase 8, предполагаемый эндогенных ингибиторов necroptosis, которая держит в страхе necroptosis. RIPK1 связывается и активирует RIPK3. Еще один способ, чтобы активировать necroptosis — через Толл подобные рецепторы TLR3/TLR4 сигнализации, который привлекает и активирует RIPK3 через МДП домен содержащих вызывая адаптер-интерферона β (TRIF)21. Еще еще один способ умереть от necroptosis является активация ДНК датчика DAI, который непосредственно занимается и активирует RIPK322.
MLKL — цитозольной белок состоит из N-терминальный спирали расслоение (NB) домена и домен pseudokinase C-терминал (psKD) соединены регулирования Брейс область3. В нормальных клетках MLKL находится в цитозоле, где он считается неактивного комплекса с RIPK314. Активация necroptosis вызывает фосфорилирование RIPK3 MLKL в петле активации psKD, и потенциально дополнительные сайты в NB и фигурная скобка3,15,23. Фосфорилирование вызывает конформационные изменения в MLKL, что приводит к диссоциации от RIPK314. Плохо понимали конформационные изменения версии скобу с psKD24. Брейс, которая содержит 2 спиралей, посредником олигомеризации MLKL в предполагаемый тример через C-терминала спирали25. N-терминальный спирали скобу подавляет NB домен, который имеет важное значение для мембраны permeabilization24,26. В изоляции NB домен достаточно, чтобы побудить плазматической мембраны permeabilization и necroptosis16,24,27. Про necroptotic активность NB была воссоздана в мыши эмбриональных фибробластов в MLKL (mlkl– / – MEFs). NB — это домен привязки липидов, что преимущественно занимается дифосфат фосфатидилинозитол 4,5 фосфолипидов (пункт2). Мы предложили поэтапного механизм активации MLKL, в котором Брейс олигомеризации облегчает набор MLKL к плазматической мембране через слабого взаимодействия NB с PIP2 полярные начальник группы24. В мембраны NB подвергается регулируемого воздействия дополнительного высокоспецифичные связывающие сайта для пункта2, который замаскированы скобу в неактивных MLKL. В целом несколько взаимодействий NB с PIP2 дестабилизировать плазматической мембраны, ведущих к ее разрыву, хотя молекулярный механизм этих событий не выяснены.
Здесь мы иллюстрируем конкретные методы, используемые для описания функции MLKL как палач necroptosis24. В частности мы сосредоточены на самых минимальных домен MLKL, NB и фигурной скобкой (НББ), который регулируется Брейс торможение и может быть активировано через насильственных димеризации побудить плазмы плодного и necroptosis. Мы описываем наши системы индуцибельной выражение в сочетании с насильственных наркотиков индуцированной FKBP-опосредованной димеризации для клеток и электронной микроскопии клетки проходят necroptosis. Кроме того мы показываем наши в vitro ЯМР анализ взаимодействия Нацбанка с phosphatidylinositols (PIPs).
Мы предоставляем протоколы для методов, которые мы объединили причастны MLKL как предполагаемый палач плазматической мембраны разрыв24. В дополнение к расшифровке регулирования сети, которая регулирует MLKL-опосредованной necroptosis, эти методы может использоваться самостоятель…
The authors have nothing to disclose.
Нет.
Cloning and cell line generation | |||
pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
NMR | |||
15N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
Specialized Equipment | |||
IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
Software | |||
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |