Клеточная чувствительность является ключевым фактором в развитии хронических возрастных патологий. Идентификация терапевтических средств, которые нацелены на старческие клетки, показывает перспективу для расширения здорового старения. Здесь мы представляем новый ассс для проверки для выявления сенотерапии на основе измерения сенесценции, связанной с активностью в одиночных клетках.
Чувствительность клеток является одной из отличительных черт старения, как известно, негативно влияет на здоровую продолжительность жизни. Препараты, способные убивать старческие клетки специально в клеточной культуре, называют сенолитикой, могут уменьшить бремя старнейки клеток in vivo и расширить продолжительность жизни. На сегодняшний день выявлено несколько классов сенолитики, включая ингибиторы HSP90, ингибиторы семейства Bcl-2, пиперлонгумин, пептид ингибитор FOXO4 и сочетание дасатиниба/кверцетина. Обнаружение SA–з-Gal при повышенном лисосомальном рН является одним из наиболее характерных маркеров для обнаружения старческих клеток. Измерения живых клеток, связанных с сенесценцией, ассоциированной активностью (SA-q-Gal) с использованием флуоресцентного субстрата C12FDG в сочетании с определением общего числа клеток с помощью ДНК, интеркалирующей краситель Hoechst, открывает возможность экран для сенотерапевтических препаратов, которые либо уменьшают общую активность SA-и-Gal путем уничтожения старческих клеток (сенолитики) или путем подавления SA-и-Gal и других фенотипов старческих клеток (сеноморфики). Использование платформы для приобретения и анализа высокой содержания флуоресцентных изображений позволяет быстро, высокой пропускной проверки библиотек лекарственных средств для воздействия на SA-и-Gal, морфологию клеток и номер клеток.
Сотовый сенесценции был описан в первый раз Леонард Хейфлик и Пол Мурхед, который показал, что нормальные клетки имели ограниченную способность размножаться в культуре1. Чувствительные клетки не размножаться, несмотря на наличие питательных веществ, факторы роста и отсутствие ингибирования контакта, но остаются метаболически активными2. Это явление известно как репликативное сенесценции и в основном связано с сокращением теломер, по крайней мере в клетках человека3. Дальнейшие исследования показали, что клетки также могут подвергаться сенесценции в ответ на другие стимулы, такие как онкогенный стресс (онкоген индуцированный сенесценции, ОИС), повреждение ДНК, цитотоксические препараты, или облучение (стресс индуцированного сенесценции, SIS)4 , 5 , 6. В ответ на повреждение ДНК, в том числе эрозии теломер, клетки либо senesce, начать неконтролируемый рост клеток, или пройти апоптоз, если повреждение не может быть восстановлена. В этом случае, ценение клеток, кажется, полезно, как он действует в опухоли подавляет образом2. В отличие от этого, сенесценция увеличивается со старением из-за накопления повреждения клеток, включая повреждение ДНК. Так как старческие клетки могут выделять цитокины, металлопротеины и факторы роста, называемые сенесценции связанных секреторный фенотип (SASP), это возрастно-зависимое увеличение клеточного сенесценции и SASP способствует снижению ткани гомеостаза и впоследствии старения. Кроме того, это возрастно-зависимое увеличение бремени старения, как известно, вызывают метаболические заболевания, чувствительность к стрессу, синдромы прогерии, и нарушение исцеления7,8 и, в частности, отвечает за многочисленные возрастные заболеваний, таких как атеросклероз, остеоартрит, мышечная дегенерация, образование язвы, и болезнь Альцгеймера9,10,11,12,13. Устранение старческих клеток может помочь предотвратить или отсрочить дисфункцию тканей и продлить healthspan14. Это было показано в трансгенных моделях мыши14,15,16, а также с помощью сеноличных препаратов и комбинаций лекарств, которые были обнаружены как с помощью усилий по скринингу наркотиков и биоинформатический анализ пути, индуцированные специально в старческих клетках17,18,19,20,21,22. Выявление более оптимальных сенотерапевтических препаратов, способных более эффективно снизить бремя старческих клеток, является важным следующим шагом в развитии терапевтических подходов к здоровому старению.
Чувствительные клетки имеют характерные фенотипические и молекулярные особенности, как в культуре, так и в vivo. Эти маркеры сенесценции могут быть либо причиной, либо результатом индукции сенесценции, либо побочным продуктом молекулярных изменений в этих клетках. Тем не менее, ни один маркер не найден конкретно в старческих клетках. В настоящее время, сенесценция связанных й-galactosidase (SA-я-Гал) обнаружение является одним из наиболее характерных и установленных одноклеточных методов для измерения сенесценции в пробирке и in vivo. СА-З-Гал – это лизосомальная гидролаза с оптимальной ферментативной активностью при рН 4. Измерение его активности при рН 6 возможно, потому что старческие клетки показывают повышенную лисосомальную активность23,24. Для живых клеток, увеличение лизосомального рН получается путем лизосомальной щелочной с вакуолярной H -ATPase ингибитор Bafilomycin A1 или эндосомальный ингибификатор подкисления хлорохин25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein Ди-з-D-galactopyranoside (C12FDG) используется в качестве субстрата в живых клетках, как он сохраняет расщепляние продукта в клетках из-за его 12 углеродных липофильных moiety25. Важно отметить, что сама деятельность SA-q-Gal не связана напрямую с каким-либо путем, выявленным в старческих клетках, и не является необходимой для того, чтобы вызвать сенесценцию. С помощью этого отзыва, старческие клетки могут быть определены даже в неоднородных популяций клеток и старения тканей, таких как биопсии кожи от пожилых людей. Он также был использован, чтобы показать корреляцию между старением клеток и старения23, как это надежный маркер для обнаружения старческих клеток в нескольких организмах и условиях27,28,29, 30. Здесь описывается скрининговый анализ с высокой пропускной результатом SA-‘-Gal, основанный на флуоресцентном субстрате C12FDG с использованием первичных эмбриональных фибробластов мыши (MEFs) с надежно окислительным стрессом, индуцированным клеточным сенесценцией, и описаны его преимущества и недостатки обсуждаются. Хотя этот анализ может быть выполнен с различными типами клеток, использование Ercc1-дефицит,ремонт ДНК нарушения MEFs позволяет более быстроиндукции сенесценции в условиях окислительного стресса. У мышей снижение экспрессии эндонуклеи реаниализа ДНК ERCC1-XPF вызывает нарушение репарации ДНК, ускоренное накопление эндогенных повреждений ДНК, повышенную ROS, митохондриальную дисфункцию, повышенную старческой клеточной нагрузки, потерю функции стволовых клеток и преждевременное старение, аналогично естественному старению31,32. Аналогичным образом, Ercc1-дефицитныеMEFs проходят сенесценцию быстрее в культуре17. Важной особенностью старческого игпромата meF является то, что каждая скважина имеет смесь старческих и нестареческих клеток, что позволяет четко проявлять старческие клеточные эффекты. Однако, хотя мы считаем, что использование окислительного стресса в первичных клетках, чтобы вызвать сенесценцию является более физиологическим, этот анализ также может быть использован с клеточными линиями, где сенесценция индуцируется с ДНК повреждающих агентов, таких как этопозид или облучение.
СА-З-Гал является четко определенным биомаркером клеточного сенесценции, первоначально обнаруженным Димри и др. (1995), показывающий, что старческие фибробласты человека имеют повышенную активность SA-и-Gal при оценке на рН 623 по сравнению с размножающимися клетками. Между…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана NIH Grants AG043376 (Проект 2 и Ядро А, ДНР; Проект 1 и Core B, LJN) и AG056278 (Проект 3 и Ядро A, PDR; и Проект 2, LJN) и грант от Фонда Гленна (LJN).
DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |