Summary

Einsatz von hämatopoetischen Stammzelltransplantation zu beurteilen, den Ursprung des myelodysplastischen Syndroms

Published: October 03, 2018
doi:

Summary

Wir beschreiben die Verwendung von hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Das maligne Potential der gentechnisch veränderten blutbildenden Zellen zu beurteilen. HSCT ist nützlich für die Bewertung der verschiedenen malignen hämatopoetischen Zellen in Vivo sowie die Generierung einer großen Kohorte von Mäusen mit myelodysplastischen Syndromen (MDS) oder Leukämie um neue Therapien zu bewerten.

Abstract

Myelodysplastischen Syndromen (MDS) sind eine heterogene Gruppe von Hämatopoetischen Stammzellen-Störungen, die durch ineffektive Hämatopoese, peripherem Blut Leukopenie, Dysplasie und eine Neigung für die Transformation zu akuter Leukämie definiert sind. NUP98-HOXD13 (NHD13) Transgene Mäuse rekapitulieren menschlichen MDS in Bezug auf die peripheren Blut Leukopenie, Dysplasie und Transformation zu akuter Leukämie. Wir zeigten bisher, dass MDS von gentechnisch hergestellten Maus mit MDS an Wildtyp Empfänger übertragen werden könnte, durch die Transplantation von MDS Knochenmark kernhaltigen Zellen (BMNC). Mehr die MDS-Zelle Herkunft klar zu verstehen, haben wir Konzepte für spezifische verpflanzen, immunophenotypisch definiert hämatopoetische Teilmengen. In diesem Artikel beschreiben wir den Prozess der Isolierung und Transplantation bestimmte Populationen von Hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen. Nach Transplantation beschreiben wir Ansätze zur Beurteilung der Effizienz der Transplantation und Persistenz der MDS Spenderzellen.

Introduction

Myelodysplastischen Syndromen (MDS) repräsentieren eine vielfältige Reihe von klonalen Blutkrankheiten, gekennzeichnet durch ineffektive Hämatopoese, morphologische Nachweis der Dysplasie und einer Neigung für die Transformation auf akute myeloische Leukämie (AML)1,2 ,3,4. Ineffektive Hämatopoese ist anerkannt als eine Verhaftung Reifung im Knochenmark und Ergebnisse im peripheren Blut zytopenien trotz hyperzelluläres Knochenmark1,3. Die Inzidenz von MDS wurde verschiedentlich als 2-12 Fälle pro 100.000 Personen pro Jahr in den Vereinigten Staaten geschätzt, und die Inzidenz von MDS steigt mit dem Alter, so dass dies eine wichtige Voraussetzung, angesichts der alternden Bevölkerung US3zu verstehen, 5. Obwohl die meisten Fälle von MDS keine klare Ursache haben, sind einige Fälle von MDS vermutlich aufgrund der Exposition gegenüber bekannten genotoxischen Agenzien, einschließlich Lösungsmittel wie Benzol und Krebs-Chemotherapie-6.

MDS-Patienten haben in der Regel Mutationen in der MDS Zellen7erworben. Obwohl relativ selten, haben eine Reihe von MDS-Patienten ausgewogenere chromosomale Translokationen Gene z. B. EVI1, NUP98, RUNX1 und MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman) erworben. Unser Labor hat ein langjähriges Interesse an Chromosom Translokationen, die NUP98 gen8beinhalten. Transgene Mäuse, express, ein NUP98-HOXD13 (NHD13)-Transgen geregelt durch den Projektträger Vav1 und Enhancer-Elemente zeigt alle Schlüsselfunktionen der MDS, einschließlich der peripheren Blut Leukopenie, morphologische Nachweis der Dysplasie und Transformation zu AML9 .

Obwohl MDS für mehr als 60 Jahren10anerkannt wurden und gelten als eine klonale Stammzell-Störung, wurden Bemühungen zur menschlichen MDS-Zelle in immungeschwächte Mäuse weiterhin weitgehend erfolglos, weil die MDS-Zellen schlecht11weiterhin, 12,13,14 und die Mäuse entwickeln keine klinischen Erkrankung. In einer Bemühung zu identifizieren, welche hämatopoetischen Zellen MDS übertragen können, wir wandte sich an das NHD13-Modell, und zeigte, dass wir MDS als Krankheit Einheit, die alle Merkmale der Kardinal menschlichen MDS weiterhin könnte, einschließlich der peripheren Blut zytopenien zeigten Dysplasie, und Transformation, AML15. In diesem Bericht stellen wir die technischen Details dieser Experimente sowie Ansätze für weitere fraktionieren Hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen (HSPC), in einer Bemühung, MDS-initiierenden Zellen zu identifizieren.

Protocol

Die Tieren in diesem Artikel beschriebenen Verfahren wurde vom National Cancer Institute in Bethesda Animal Care und Use Committee genehmigt, und entsprechen den Richtlinien enthaltenen The Public Health Service Policy auf Humane Pflege und Verwendung von Labortieren, die Tierschutzgesetz und die Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Zelle-Vorbereitung Ernte des Knochenmarks kernhaltigen Zelle (BMNC) Verwenden Sie nur sterile Materialien. Sterilisieren …

Representative Results

Wir zeigen repräsentative Zahlen für Ergebnisse mehrerer Experimente. Abbildung 1 zeigt eine repräsentative Durchflusszytometrie Sortierung Experiment. Während normaler Hämatopoetischer Differenzierung wie Zellen mit einer bestimmten hämatopoetischen Linie engagieren sie erwerben Linie definieren Zelle oberflächenmarker und das Potenzial für Selbsterneuerung zu verlieren. Daher ist in Wildtyp Mäusen, Stammzell-Selbsterneuerung auf Linie-Negative BMNC…

Discussion

Zwar MDS eine klonale hämatopoetische Stammzell-Störung, mdb “Stamm”, oder initiierende Zellen wurden noch nicht charakterisiert. Wir zuvor nachweislich MDS transplantierbaren WT-Mäusen mit dem Knochenmark aus NHD13 Mäusen durch HSZT, gekennzeichnet durch macrocytic Anämie, Leukopenie, Neutropenie und morphologische Nachweis der Dysplasie15sein können. Darüber hinaus identifiziert wettbewerbsfähige Wiederbesiedlung Assays einen Vorteil Wachstum von Zellen aus dem Knochenmark NHD13 MDS. Zus…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch intramurale Research Program des National Cancer Institute, National Institutes of Health (Zuschuss Zahlen ZIA SC 010378 und v. 010983).

Materials

14 mL round bottom tube Falcon 352057
Hank's balanced salt solution Lonza 10-527F
Anti-CD45.2 antibody Southern Biotech 1800-15 LOT# A077-T044O
3 mL Syringe Monoject 8881513934
27-G needle BD 305109
20-G needle BD 305176
Lineage Cocktail Miltenyi 130-090-858 LOT# 5170418221
Anti-Biotin antibodies Miltenyi 130-113-288 LOT# 5171109046
1 mL Syringe Excelint 26027 Insulin Syringe
Heating Lamp Thermo Fisher Scientific E70001901
FACS machine Cytec FACScan 2 lasers, 5 color detectors
FACS sorting instrument Beckman Coulter MOFLO ASTRIOS 5 lasers, 23 parameters, 6 population sorting simulteneously
Propidium Iodide Thermo Fisher Scientific P3566
Gamma Irradiator Best Theratronics Gammacell 40
Blood collection tube RAM scientific 76011
Recipient mice Charles River B6-LY5.1/Cr, CD45.1
NUP98-HOXD13 mice n/a C57Bl/6, CD45.2 Colony maintained at NIH
5 mL round bottom tube Falcon 352058

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Cite This Article
Chung, Y. J., Khawaja, G., Wolcott, K. M., Aplan, P. D. Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome. J. Vis. Exp. (140), e58140, doi:10.3791/58140 (2018).

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