Summary

Uso de transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a origem da síndrome mielodisplásica

Published: October 03, 2018
doi:

Summary

Nós descrevemos o uso do transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) para avaliar o potencial maligno das células hematopoiéticas geneticamente modificados. TCTH é útil para avaliar várias células hematopoiéticas malignas na vivo , bem como gerar uma grande coorte de ratos com Síndromes Mielodisplásicas (MDS) ou leucemia para avaliar novas terapias.

Abstract

Síndromes Mielodisplásicas (MDS) são um grupo diverso de desordens de células-tronco hematopoiéticas são definidos pela hematopoiese ineficaz, sangue periférico citopenias, displasia e uma propensão para a transformação para leucemia aguda. NUP98-HOXD13 (NHD13) ratos transgénicos recapitular MDS humana em termos de citopenias de sangue periférico, displasia e transformação para leucemia aguda. Demonstramos anteriormente que a MDS poderão ser transferidos de um rato geneticamente modificado com MDS para destinatários do selvagem-tipo por transplante de células de medula óssea nucleated MDS (BMNC). A mais claramente compreender a célula MDS de origem, desenvolvemos abordagens específicas de transplante, immunophenotypically definidos hematopoiéticos subconjuntos. Neste artigo, descrevemos o processo de isolar e transplantar populações específicas de tronco hematopoiético e células progenitoras. Após transplante, descrevemos abordagens para avaliar a eficiência do transplante e a persistência das células MDS doador.

Introduction

Síndromes Mielodisplásicas (MDS) representam um conjunto diverso de desordens de sangue clonal caracterizada pela hematopoiese ineficaz, evidências morfológicas de displasia e uma propensão para a transformação para leucemia mieloide aguda (LMA)1,2 ,3,4. Hematopoiese ineficaz é reconhecido como uma prisão de maturação na medula óssea, resultando em sangue periférico citopenias apesar de medula hipercelular1,3. A incidência de MDS foi estimada vària como 2-12 casos por 100.000 pessoas por ano nos Estados Unidos, e a incidência de MDS aumenta com a idade, tornando esta uma condição importante para entender tendo em conta o envelhecimento da população dos EUA3, 5. Embora a maioria dos casos de MDS tem sem etiologia, alguns casos de MDS são pensados para ser devido à exposição a agentes genotóxicos conhecidos, incluindo solventes tais como benzina e quimioterapia de câncer6.

Pacientes MDS normalmente adquiriram mutações no MDS células7. Embora relativamente incomum, um número de pacientes MDS adquiriram equilibradas translocações cromossômicas envolvendo genes tais como NUP98, EVI1, RUNX1 e MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Nosso laboratório tem um interesse de longa data em translocações cromossómicas, que envolvem o gene de NUP988. Ratos transgénicos que expressa um transgene NUP98-HOXD13 (NHD13), regulado pelo promotor Vav1 e elementos de potenciador exibem todos os principais recursos do MDS, incluindo citopenias de sangue periférico, evidências morfológicas de displasia e transformação para LMA9 .

Embora o MDS foram reconhecidos por mais de 60 anos,10e são considerados ser uma desordem clonal de células estaminais, os esforços para engraft célula humana do MDS em camundongos imunodeficientes foram pela maior parte mal sucedidos, porque as células MDS engraft mal11, 12,13,14 e os ratos não desenvolvem a doença clínica. Em um esforço para identificar quais células hematopoiéticas podem transmitir MDS, viramos para o modelo de NHD13 e mostrou que nós poderíamos engraft MDS como uma entidade de doença que mostrou todas as características cardinais da MDS humano, incluindo sangue periférico citopenias, displasia, e transformação para LMA15. Neste relatório, nós apresentamos os detalhes técnicos destas experiências, bem como abordagens para fracionar mais tronco hematopoiético e células precursoras (HSPC), em um esforço para identificar células MDS-iniciando.

Protocol

Os animais procedimentos descritos neste artigo foram aprovados pelo Instituto Nacional de câncer, no Comité de uso e cuidado do Animal de Bethesda e estão em conformidade com as políticas contidas a política de serviço de saúde pública no cuidado humano e uso de animais de laboratório, o Ato do bem-estar animal e o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório. 1. preparação da pilha Colheita da medula óssea célula nucleada (BMNC) Use apenas o material …

Representative Results

Nós mostramos figuras representativas para obter resultados de vários experimentos. A Figura 1 mostra uma citometria de fluxo representativo classificação experimento. Durante a diferenciação hematopoiética normal, como as células se tornam comprometidas com uma linhagem específica de hematopoiética, eles adquirem marcadores de superfície celular linhagem-definição e perdem o potencial de auto-renovação. Portanto, em ratos do selvagem-tipo, aut…

Discussion

Embora MDS são uma desordem clonal células-tronco hematopoiéticas, os MDS “tronco”, ou células de iniciante, ainda não foram caracterizados. Demonstramos anteriormente que o MDS pode ser para transplante para camundongos WT usando a medula óssea de ratos NHD13 por TCTH, caracterizada por anemia macrocítica, leucopenia, neutropenia e evidências morfológicas de displasia15. Além disso, ensaios de repovoamento do competidor identificaram uma vantagem de crescimento de células de medula ós…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa Intramural do Instituto Nacional de câncer, National Institutes of Health (conceder números ZIA SC 010378 e BC 010983).

Materials

14 mL round bottom tube Falcon 352057
Hank's balanced salt solution Lonza 10-527F
Anti-CD45.2 antibody Southern Biotech 1800-15 LOT# A077-T044O
3 mL Syringe Monoject 8881513934
27-G needle BD 305109
20-G needle BD 305176
Lineage Cocktail Miltenyi 130-090-858 LOT# 5170418221
Anti-Biotin antibodies Miltenyi 130-113-288 LOT# 5171109046
1 mL Syringe Excelint 26027 Insulin Syringe
Heating Lamp Thermo Fisher Scientific E70001901
FACS machine Cytec FACScan 2 lasers, 5 color detectors
FACS sorting instrument Beckman Coulter MOFLO ASTRIOS 5 lasers, 23 parameters, 6 population sorting simulteneously
Propidium Iodide Thermo Fisher Scientific P3566
Gamma Irradiator Best Theratronics Gammacell 40
Blood collection tube RAM scientific 76011
Recipient mice Charles River B6-LY5.1/Cr, CD45.1
NUP98-HOXD13 mice n/a C57Bl/6, CD45.2 Colony maintained at NIH
5 mL round bottom tube Falcon 352058

References

  1. Corey, S. J., et al. Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).
  2. Garcia-Manero, G. Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).
  3. Heaney, M. L., Golde, D. W. Myelodysplasia. The New England Journal of Medicine. 340 (21), 1649-1660 (1999).
  4. Nimer, S. D. Myelodysplastic syndromes. Blood. 111 (10), 4841-4851 (2008).
  5. Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics. International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).
  6. Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia. Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).
  7. Uy, G. L., et al. Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy. Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).
  8. Gough, S. M., Slape, C. I., Aplan, P. D. NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights. Blood. 118 (24), 6247-6257 (2011).
  9. Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. NUP98-HOXD13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
  10. Block, M., Jacobson, L. O., Bethard, W. F. Preleukemic acute human leukemia. Journal of the American Medical Association. 152 (11), 1018-1028 (1953).
  11. Thanopoulou, E., et al. Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome. Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).
  12. Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells. Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).
  13. Benito, A. I., et al. NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors. Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).
  14. Medyouf, H., et al. Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit. Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).
  15. Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).
  16. Pietras, E. M., et al. Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  17. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
  18. Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome. PLoS One. 12 (9), e0185219 (2017).

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Cite This Article
Chung, Y. J., Khawaja, G., Wolcott, K. M., Aplan, P. D. Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome. J. Vis. Exp. (140), e58140, doi:10.3791/58140 (2018).

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