Gebruik van Autometallography om te lokaliseren en semi-kwantificeren zilver in walvisachtigen weefsels
Summary
Een protocol wordt uitgereikt om te lokaliseren Ag in walvisachtigen weefsels van de lever en de nieren door autometallography. Bovendien is een nieuwe bepaling, genaamd de walvisachtigen histologische Ag assay (CHAA) ontwikkeld voor het inschatten van de concentraties van de Ag in deze weefsels.
Abstract
Zilveren nanodeeltjes (AgNPs) zijn uitgebreid gebruikt in commerciële producten, met inbegrip van textiel, cosmetica en gezondheidszorg items, als gevolg van hun sterke antimicrobiële effecten. Zij ook mogen vrijkomen in het milieu en zich ophopen in de Oceaan. Daarom, AgNPs zijn de belangrijkste bron van verontreiniging van de Ag en bewustmaking van de milieutoxiciteit van Ag groeit. Eerdere studies hebben aangetoond de bioaccumulatie (bij producenten) en vergroting (in consumenten/roofdieren) van Ag. Walvisachtigen, kunnen als de vijanden van de apex van de Oceaan, negatief getroffen zijn door de Ag/Ag-verbindingen. Hoewel de concentraties van Ag/Ag verbindingen in walvisachtigen weefsels kunnen worden gemeten door inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie (ICP-MS), wordt het gebruik van ICP-MS beperkt door haar hoge kapitaalkosten en de eis voor weefsel opslag/voorbereiding. Dus, een autometallography (AMG) methode met een afbeelding kwantitatieve analyse met behulp van formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) weefsel is wellicht een adjuvans methode te lokaliseren Ag distributie op het niveau van de suborgan en de raming van de concentratie van de Ag in walvisachtigen weefsels. De AMG positieve signalen zijn voornamelijk bruin aan zwarte korrels van verschillende grootte in het cytoplasma van proximale renale tubulaire epitheel, hepatocyten en Kupffer cellen. Af en toe, worden sommige amorf goudgeel tot bruin AMG positieve signalen in de lumen en kelder membraan van sommige proximale renale tubuli vermeld. De assay voor het schatten van de Ag-concentratie heet het Cetacean histologische Ag Assay (CHAA), oftewel een regressiemodel vastgesteld door de gegevens uit afbeelding kwantitatieve analyse van de AMG methode en ICP-MS. Het gebruik van AMG met CHAA te lokaliseren en semi-kwantificeren zware metalen biedt een handige methode voor spatio-temporele en cross-soorten studies.
Introduction
Zilveren nanodeeltjes (AgNPs) zijn uitgebreid gebruikt in commerciële producten, met inbegrip van textiel, cosmetica en gezondheidszorg items, als gevolg van hun grote antimicrobiële effecten1,2. De productie van AgNPs en het aantal AgNP-bevattende producten zijn dan ook toegenomen van tijd3,4. Echter, AgNPs kunnen worden vrijgegeven in het milieu en zich ophopen in de oceaan5,6. Zijn ze de belangrijkste bron van verontreiniging van de Ag, en de bewustwording van de milieutoxiciteit van Ag groeit.
De status van AgNPs en Ag in het mariene milieu is ingewikkeld en voortdurend veranderende. Eerdere studies hebben aangegeven dat de AgNPs blijven kunnen als deeltjes, statistische, ontbinden, met verschillende chemische soorten reageren of worden geregenereerd van Ag+ ionen7,8. Verschillende soorten Ag verbindingen, zoals AgCl, gevonden in mariene sedimenten, waar ze door benthische organismen ingenomen kunnen worden en geef de voedselketen9,10. Volgens een eerdere studie uitgevoerd in het Chi-ku lagune gebied langs de zuidwestelijke kust van Taiwan, de concentraties van de Ag van mariene sedimenten zijn uiterst lage en vergelijkbaar met de aardkorst overvloed, en die van de vis-lever weefsel zijn meestal onder de detectie beperken (< 0,025 μg/g NAT/NAT)11. Vorige onderzoeken in verschillende landen hebben echter aangetoond dat relatief hoge concentraties van de Ag in de levers van walvisachtigen12,13. De concentratie van de Ag in de levers van walvisachtigen is leeftijd afhankelijk, suggereert dat de bron van de Ag in hun lichaam waarschijnlijk hun prooi12 is. Deze bevindingen verder stellen voor de biomagnificatie van Ag in dieren op hogere trofische niveaus. Walvisachtigen, kunnen als de apex roofdieren in de Oceaan, hebben geleden negatieve gezondheidseffecten veroorzaakt door Ag/Ag verbindingen12,13,14. Belangrijkst, zoals walvisachtigen zijn mensen zoogdieren en de negatieve gezondheid gevolgen veroorzaakt door Ag/Ag verbindingen in walvisachtigen kunnen zich ook voordoen bij mensen. Met andere woorden, zou de walvisachtigen sentinel dieren voor de gezondheid van het mariene milieu en de mens. Effecten op de gezondheid, het weefsel distributie en concentratie van de Ag in walvisachtigen zijn daarom van groot belang.
Hoewel de concentraties van Ag/Ag verbindingen in walvisachtigen weefsels kunnen worden gemeten door inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie (ICP-MS), wordt het gebruik van ICP-MS beperkt door haar hoge kapitaalkosten (instrument en onderhoud) en de vereisten voor opslag van weefsel /Preparation12,15. Bovendien is het gewoonlijk moeilijk uitgebreide weefselmonsters in alle onderzoeken van de gestrande walvisachtigen gevallen als gevolg van logistieke problemen, een tekort aan arbeidskrachten en een gebrek aan verwante bronnen12te verzamelen. De bevroren weefselmonsters voor ICP-MS-analyse zijn niet gemakkelijk opgeslagen vanwege beperkte koeling ruimte en bevroren weefselsteekproeven toe te schrijven aan gebroken koeling apparatuur12mag worden weggegooid. Deze bovengenoemde obstakels belemmeren onderzoek naar verontreinigingen in walvisachtigen weefsels door ICP-MS-analyse met behulp van bevroren weefselmonsters. Daarentegen formaline vaste weefselsteekproeven zijn relatief gemakkelijk te verzamelen tijdens de necropsie van dode-stranded walvisachtigen. Daarom is het nodig om een makkelijk te gebruiken en goedkope methode voor het detecteren/maatregel de zware metalen in walvisachtigen weefsels met behulp van formaline vaste weefselmonsters.
Hoewel de suborgan distributies en concentraties van alkali en alkaline earth metalen kunnen worden gewijzigd tijdens de formaline-vaste, geweest paraffine-ingebedde (FFPE) proces, alleen minder effecten op overgangsmetalen, zoals Ag, bekende16. Vandaar, FFPE weefsel heeft beschouwd als een ideale steekproef bron voor metalen lokalisatie en metingen16,17. Autometallography (AMG), een histochemische proces, zware metalen als variabel formaat goudgeel tot zwarte positieve signalen van de AMG op FFPE weefselsecties kunnen versterken, en deze versterkte zware metalen kunnen worden gevisualiseerd onder de lichte microscopie van18, 19 , 20 , 21. Vandaar, de AMG-methode geeft informatie over de verdelingen van de suborgan van zware metalen. Het kan belangrijke aanvullende informatie voor het bestuderen van de metabole routes van zware metalen in biologische systemen omdat ICP-MS kan alleen het meten van de concentratie van zware metalen in het orgel niveau18bieden. Bovendien is analysesoftware van digitaal beeld, zoals ImageJ, vereffend met de kwantitatieve analyse van histologische weefsel secties22,23. De variabel en middelgrote goudgeel met zwarte AMG positieve signalen van FFPE weefselsecties kan worden gekwantificeerd en methode voor het schatten van de concentraties van zware metalen. Hoewel de absolute Ag concentratie kan niet rechtstreeks worden bepaald volgens de methode van de AMG met afbeelding kwantitatieve analyse, kan worden geschat door een regressiemodel gebaseerd op de gegevens die zijn verkregen uit de kwantitatieve beeldanalyse en ICP-MS, die walvisachtigen heet histologische Ag assay (CHAA). Gezien de moeilijkheden bij de waardering van Ag concentraties door ICP-MS analyse in meest gestrande walvisachtigen, CHAA is een waardevol adjuvans methode te schatten Ag concentraties in walvisachtigen weefsels, die kunnen niet worden bepaald door analyse van de ICP-MS als gevolg van het ontbreken van bevroren weefselmonsters. Deze paper beschrijft het protocol van een histochemische techniek (AMG-methode) voor het lokaliseren van Ag op het niveau van de suborgan en een test met de naam CHAA te schatten van de Ag-concentraties in de lever en de nier weefsels van walvisachtigen.
Figuur 1: stroomdiagram beeltenis van de vaststelling en toepassing van walvisachtigen histologische Ag assay (CHAA) voor het inschatten van de Ag concentraties. CHAA = walvisachtigen histologische Ag assay, FFPE = formaline-vaste, paraffine-ingebedde, ICP-MS = inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van het onderzoek van het artikel is een adjuvans-methode, de verdeling van de Ag op suborgan niveaus wilt evalueren en te schatten Ag concentraties in walvisachtigen weefsels vast te stellen. De huidige protocollen bevatten 1) bepaling van de concentratie van de Ag in walvisachtigen weefsels door ICP-MS, 2) AMG analyse van paar-matched weefselsteekproeven met bekende Ag concentraties, 3) vaststelling van het regressiemodel (CHAA) voor het inschatten van de Ag-concentraties door AMG positieve waarden, 4) evaluat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken het Taiwan Cetacean Stranding netwerk voor sample collectie en opslag, met inbegrip van de Taiwan Cetacean Society, Taipei; De walvisachtige onderzoekslaboratorium (Prof. Lien-Siang Chou), het Instituut voor ecologie en evolutiebiologie, National Taiwan University, Taipei; het Nationaal Museum van natuurwetenschappen (Dr. Chiou-Ju Yao), Taichung; en de mariene biologie & Cetacean Research Center, nationale Cheng-Kung Universiteit. Wij danken ook de bosbouw Bureau, de Raad van landbouw, de uitvoerende Yuan voor hun verblijfsvergunning.
Materials
| HQ Silver enhancement kit | Nanoprobes | #2012 | |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Paraffin |
| 100% Ethanol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4026 | |
| Non-Xylene | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4328 | |
| Silane coated slide | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 511614 | |
| Cover glass (25 x 50 mm) | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 24501 | |
| Malinol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 20092 | |
| GM Haematoxylin Staining | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 3008-1 | |
| 10% neutral buffered formalin solution | Chin I Pao Co., Ltd | — | |
| Tip (1000 μL) | MDBio, Inc. | 1000 | |
| PIPETMAN Classic P1000 | Gilson, Inc. | F123602 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | GeneDireX, Inc. | PC115-0500 | |
| Dogfish liver | National Research Council of Canada | DOLT-2 | |
| Dogfish muscle | National Research Council of Canada | DORM-2 | |
| Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) | PerkinElmer Inc. | PE-SCIEX ELAN 6100 DRC | |
| FreeZone 6 liter freeze dry system | Labconco | 7752030 | For freeze drying |
| BRAND® SILBERBRAND volumetric flask | Merck | Z326283 | |
| 30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure | Savillex Corporation | 200-030-12 | For diagestion |
| Nitric acid, superpur®, 65.0% | Merck | 1.00441 | For diagestion |
| Hot Plate/Stirrers | Corning® | PC-220 | For diagestion |
| High Shear lab mixer | Silverson | SL2T | For homogenization |
| Sterile polypropylene sample jar (250mL) | Thermo Scientific™ | 6186L05 | For homogenization |
| Digital camera | Nikon Corporation | DS-Fi2 | |
| Light microscope | Nikon Corporation | ECLIPSE Ni-U | |
| Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome | Thermo Scientific™ | A78100001H | |
| Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome | Sakura | 1429 | |
| Microtome blade S35 | FEATHER® | 207500000 | |
| Slide staining dish and cover | Brain Research Laboratories | #3215 | |
| Steel staining rack | Brain Research Laboratories | #3003 | |
| Shandon embedding center | Thermo Scientific™ | S-EC | |
| Shandon Citadel® tissue processor | Thermo Scientific™ | 69800003 | |
| Slide warmer | Lab-Line Instruments | 26005 | |
| Water bath | Shandon Capshaw | 3964 | |
| Filter paper | Merck | 1541-070 | |
| Prism 6.01 for windows | GraphPad Software | Statistic software | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Stainless steel tissue embedding mould | Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd | RD-TBM003 | For paraffin emedding |
References
- McGillicuddy, E., et al. Silver nanoparticles in the environment: Sources, detection and ecotoxicology. Science Total Environment. 575, 231-246 (2017).
- Yu, S. J., Yin, Y. G., Liu, J. F. Silver nanoparticles in the environment. Environmental Science: Processes and Impacts. 15 (1), 78-92 (2013).
- Hansen, S. F., et al. Nanoproducts- what is actually available to European consumers?. Environmental Science: Nano. 3 (1), 169-180 (2016).
- Vance, M. E., et al. Nanotechnology in the real world: Redeveloping the nanomaterial consumer products inventory. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 1769-1780 (2015).
- Farre, M., Gajda-Schrantz, K., Kantiani, L., Barcelo, D. Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (1), 81-95 (2009).
- Walters, C. R., Pool, E. J., Somerset, V. S. Ecotoxicity of silver nanomaterials in the aquatic environment: a review of literature and gaps in nano-toxicological research. Journal of Environmental Science and Health. Part A, Toxic/hazardous Substances & Environmental Engineering. 49 (13), 1588-1601 (2014).
- Levard, C., Hotze, E. M., Lowry, G. V., Brown, G. E. Environmental transformations of silver nanoparticles: impact on stability and toxicity. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6900-6914 (2012).
- Massarsky, A., Trudeau, V. L., Moon, T. W. Predicting the environmental impact of nanosilver. Environmental Toxicology and Pharmacology. 38 (3), 861-873 (2014).
- Wang, H., et al. Toxicity, bioaccumulation, and biotransformation of silver nanoparticles in marine organisms. Environmental Science and Technology. 48 (23), 13711-13717 (2014).
- Buffet, P. E., et al. A marine mesocosm study on the environmental fate of silver nanoparticles and toxicity effects on two endobenthic species: the ragworm Hediste diversicolor and the bivalve mollusc Scrobicularia plana. Science of the Total Environment. 470, 1151-1159 (2014).
- Chen, M. H. Baseline metal concentrations in sediments and fish, and the determination of bioindicators in the subtropical Chi-ku Lagoon, S W Taiwan. Marine Pollution Bulletin. 44 (7), 703-714 (2002).
- Li, W. T., et al. Investigation of silver (Ag) deposition in tissues from stranded cetaceans by autometallography (AMG). Environmental Pollution. , 534-545 (2018).
- Chen, M. H., et al. Tissue concentrations of four Taiwanese toothed cetaceans indicating the silver and cadmium pollution in the western Pacific Ocean. Marine Pollution Bulletin. 124 (2), 993-1000 (2017).
- Li, W. T., et al. Immunotoxicity of silver nanoparticles (AgNPs) on the leukocytes of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Scientific Reports. , (2018).
- Bornhorst, J. A., Hunt, J. W., Urry, F. M., McMillin, G. A. Comparison of sample preservation methods for clinical trace element analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry. American Journal of Clinical Pathology. 123 (4), 578-583 (2005).
- Bonta, M., Torok, S., Hegedus, B., Dome, B., Limbeck, A. A comparison of sample preparation strategies for biological tissues and subsequent trace element analysis using LA-ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1805-1814 (2017).
- Bischoff, K., Lamm, C., Erb, H. N., Hillebrandt, J. R. The effects of formalin fixation and tissue embedding of bovine liver on copper, iron, and zinc analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (2), 220-224 (2008).
- Miller, D. L., Yu, I. J., Genter, M. B. Use of Autometallography in Studies of Nanosilver Distribution and Toxicity. International Journal of Toxicology. 35 (1), 47-51 (2016).
- Anderson, D. S., et al. Influence of particle size on persistence and clearance of aerosolized silver nanoparticles in the rat lung. Toxicological Sciences. 144 (2), 366-381 (2015).
- Kim, W. Y., Kim, J., Park, J. D., Ryu, H. Y., Yu, I. J. Histological study of gender differences in accumulation of silver nanoparticles in kidneys of Fischer 344 rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 72 (21-22), 1279-1284 (2009).
- Danscher, G. Applications of autometallography to heavy metal toxicology. Pharmacology Toxicology. 68 (6), 414-423 (1991).
- Deroulers, C., et al. Analyzing huge pathology images with open source software. Diagnostic Pathology. 8, 92 (2013).
- Shu, J., Dolman, G. E., Duan, J., Qiu, G., Ilyas, M. Statistical colour models: an automated digital image analysis method for quantification of histological biomarkers. BioMedical Engineering Online. 15, 46 (2016).
- Geraci, J. R., Lounsbury, V. J. Specimen and data collection. Marine mammals ashore: a field guide for strandings. , 167-230 (2005).
- Shih, C. -. C., Liu, L. -. L., Chen, M. -. H., Wang, W. -. H. . Investigation of heavy metal bioaccumulation in dolphins from the coastal waters off Taiwan. , (2001).
- Liang, C. S., et al. The relationship between the striatal dopamine transporter and novelty seeking and cognitive flexibility in opioid dependence. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 74, 36-42 (2017).
- Spiess, A. N., Neumeyer, N. An evaluation of R2 as an inadequate measure for nonlinear models in pharmacological and biochemical research: a Monte Carlo approach. BMC Pharmacology. 10, 6 (2010).
- Stoltenberg, M., Danscher, G. Histochemical differentiation of autometallographically traceable metals (Au, Ag, Hg, Bi, Zn): protocols for chemical removal of separate autometallographic metal clusters in Epon sections. Histochemical Journal. 32 (11), 645-652 (2000).
- Dimitriadis, V. K., Domouhtsidou, G. P., Raftopoulou, E. Localization of Hg and Pb in the palps, the digestive gland and the gills in Mytilus galloprovincialis (L.) using autometallography and X-ray microanalysis. Environmental Pollution. 125 (3), 345-353 (2003).
- Loumbourdis, N. S., Danscher, G. Autometallographic tracing of mercury in frog liver. Environmental Pollution. 129 (2), 299-304 (2004).
- Stoltenberg, M., Larsen, A., Kemp, K., Bloch, D., Weihe, P. Autometallographic tracing of mercury in pilot whale tissues in the Faroe Islands. International Journal of Circumpolar Health. 62 (2), 182-189 (2003).
