Microemulsions 셀 무료 Xenopus 달걀 추출 물에서 세포 주기 진동의 재구성

Summary

달걀 추출 물 물에서 기름 microemulsions에서 Xenopus laevis 의 캡슐화 하 여 방법을 생체 외에서 자기 지속적인된 mitotic 진동 단일 세포 수준에서의 세대를 위한 선물이.

Abstract

단일 셀 수준에서 진동의 실시간 측정 생물 시계의 메커니즘을 밝히기 위해서 중요 하다. 대량 추출 Xenopus laevis 계란에서 준비는 되어 있지만 생화학 네트워크 기본 세포 주기 진행을 해 부에 강력한, 그들의 앙상블 평균 측정 일반적으로 이끌어 각에 불구 하 고 감쇠 진동 지속 되는 개별 발진기 시끄러운 생물 학적 시스템에서 개별 발진기 간의 완벽 한 동기화의 어려움 때문입니다. 검색 하려면 발진기의 단일 셀 역학, 우리 셀 같은 구획 Xenopus laevis 계란의 자전거 세포질 추출 물을 캡슐화에 mitotic 사이클을 다시 구성할 수 있는 물방울 기반 인공 세포 시스템을 개발. 이러한 간단한 세포질 전용 셀 30 사이클에 대 한 지속적인된 진동 전시. 핵을 가진 더 복잡 한 세포를 구축, 우리는 demembranated 정자 염색 질 시스템에서 자기 조립 핵을 방 아 쇠를 추가. 우리 염색체 응축/decondensation의 정기적인 진행을 관찰 하 고 핵 실제 셀에 같은 고장/개혁, 봉투. 이 mitotic 발진기 여러 다운스트림 mitotic 이벤트를 충실 하 게 기능을 나타냅니다. 우리는 동시에 mitotic 발진기 및 다중 채널 시간 경과 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 개별 방울에 다운스트림 프로세스의 역학을 추적 합니다. 양적 조작 및 가능성이 규제 기계와의 기능에 중요 한 통찰력을 제공 하는 단일 셀 해상도, mitotic 진동의 분석을 위한 높은 처리량 프레임 워크를 제공 하는 인공 세포 주기 시스템 시계입니다.

Introduction

Xenopus laevis 계란에서 준비 하는 세포질 추출 물 중 가장 주된 모델 oocytes, 급속 한 세포 주기 진행 및 재구성 하는 능력의 큰 볼륨을 주어 세포 주기의 생화학 연구에 대 한 대표 mitotic 이벤트 체 외에서^1,2. 이 시스템 초기 발견과 필수적인 세포 주기 레 귤 레이 터의 기계적 특성 등 다운스트림 mitotic 프로세스 뿐 아니라 성숙 촉진 인자 (MPF) 스핀 들 어셈블리 및 염색체 분리^{1 같은 수 있다 ,2,3,,45,6,7,8,9,10, 11}. Xenopus 달걀 추출 물 또한 세포 주기 시계^8,12,,1314 의 규제 네트워크의 상세한 해 부 및 DNA 손상의 연구에 대 한 사용 되었습니다. /replication 검사점¹⁵ 그리고 mitotic 스핀 들 어셈블리 검사점^16,,1718.

Xenopus 달걀 추출 물을 사용 하 여 셀의 이러한 연구는 주로 되었습니다 기반으로 대량 측정 합니다. 그러나, 기존의 대량 반응 분석 실제 셀 동작, 그들의 크기 및 반응 분자의 subcellular 공간 구획에 큰 차이가 주어 모방 하지 않을 수 있습니다. 또한, mitotic 활동의 대량 측정 전에 신속 하 게 감쇠⁸사이클의 제한 된 수를 주는 경향이 있다. 대량 반응의 이러한 단점 추가 복잡 한 시계 동적 속성 및 기능에 대 한 이해를 제공 하기 위해 추출 시스템을 방지 했습니다. 최근 연구는 셀 무료 cytostatic 요인 체포 (CSF) Xenopus 추출 물^19,20 크기 정의 셀 같은 구획에 의해 스핀 들 크기는 변조 하는 방법을 명료 하 게 도운로 캡슐화는 세포질 볼륨입니다. 그러나,이 생체 외에서 시스템은 cytostatic 요소¹의 행동에 의해 감수 제 2 분열의 분열에서 체포 하 고 세포 주기의 추가 조사에 대 한 단일 셀 수준에서 장기 지속적인된 진동 수 있는 시스템 필요 발진기입니다.

공부 하 고 단일 셀 해상도 세포 주기 진동, 우리 셀 규모, 재구성 및 개별 아사카에 여러 자기 지속적인된 mitotic 진동 프로세스의 동시 측정을 위한 높은 처리량의 시스템 개발 작은 물방울. 이 상세한 비디오 프로토콜에 10에서 300 µ m에 배열 하는 크기의 microemulsions에서 자전거 Xenopus laevis 계란 세포질을 캡슐화 하 여 인공 mitotic 진동 시스템의 창조를 설명 합니다. 이 시스템에서는, 염색체 응축과 드 응축, 핵 붕괴와 개혁, 그리고 저하 고 anaphase 기판 (예: securin-mCherry이 프로토콜에서)의 합성 등 mitotic 진동 했다 성공적으로 재구성 된다.

Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 미시간 대학에 의해 승인 되었습니다. 1. 세포 주기 재구성 및 탐지에 대 한 자료의 준비 플라스 미드 DNA 건설과 securin mCherry의 mRNA 정화에 대 한 복제 깁슨 어셈블리 PMTB2 벡터 백본, securin, 그리고 연쇄 반응 (PCR)을 통해 mCherry를 포함 하 여 3 개의 DNA 조각을 준비 하 고 정화<sup clas…

Representative Results

그림 2, 우리는이 프로토콜 모두 간단 하 고, 핵 없는 세포로 핵, 복잡 한 셀 어디 발진기 핵 형성과 변형의 주기적 교체 드라이브 mitotic 진동 생산 표시 됩니다. 핵 없는 물방울 생성 mitotic 진동 최대 30 undamped 사이클에 92 시간의 기간 동안 정기적인 합성 한 형광 기자 securin-mCherry (그림 2A)의 저하에 의해 표시 된 대로. 복잡 한 APC/…

Discussion

우리는 그 수에 체 외 재구성 및 단일 세포 수준에서 자체 지속적인된 세포 주기 진동의 장기 추적 높은 처리량 인공 세포 시스템을 개발 하기 위한 새로운 방법을 제시 했습니다. 이 메서드를 성공 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 좋은 품질을 가진 첫 번째, 갓 Xenopus 달걀 누워 계란에 비해, 오래 지속 진동 활동 추출 물을 생산 하는 경향이 있다. 둘째, 계면 안정화 microenvironmen…

Materials

Xenopus laevis frogs	Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit	QIAGEN	27104
QIAquick PCR Purification Kit (250)	QIAGEN	28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit	Ambion	AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell	Sigma-Aldrich	B2935
Calcium ionophore	Sigma-Aldrich	A23187
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	Toxic
Trichloro	Sigma-Aldrich	448931	Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactant	Ran Biotechnologies	008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads	Sigma-Aldrich	GE17-0756-01
PD-10 column	Sigma-Aldrich	GE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubing	VitroCom	5012
Olympus SZ61 Stereo Microscope	Olympus
Olympus IX83 microscope	Olympus
Olympus FV1200 confocal microscope	Olympus
NanoDrop spectrophotometer	Thermofisher	ND-2000
0.4 mL Snap-Cap Microtubes	E&K Scientific	485050-B
PureLink RNA Mini Kit	ThermoFisher（Ambion）	12183018A
Fisherbrand Analog Vortex Mixer	Fisher Scientific	2215365
Imaris	Bitplane	Version 7.3	Image analysis software