Восстановление клеточного цикла колебаний в микроэмульсий свободных клеток Xenopus яйцо экстрактов
Summary
Мы представляем метод для генерации в vitro хозрасчетных митотическая колебаний на уровне одной ячейки, инкапсулируя яйцо экстрактов Xenopus laevis в воду в масло микроэмульсий.
Abstract
В реальном времени измерение колебаний на уровне одной ячейки имеет важное значение для выявления механизмов биологические часы. Хотя массовых экстрактов из Xenopus laevis яйца были мощные в рассекает биохимических сетей, лежащие в основе прогрессирования клеточного цикла, среднее измерение их ансамбль обычно приводит к затухающих колебаний, несмотря на каждый Индивидуальные осциллятор имелось. Это из-за сложности идеальной синхронизации между отдельными осцилляторов в шумной биологических систем. Чтобы получить одноклеточных динамика осциллятора, мы разработали систему на основе капельки искусственные клетки, которая может воссоздать митотического цикла в отсеках клеток как инкапсуляция Велоспорт цитоплазматических экстракты Xenopus laevis яиц. Эти простые только цитоплазмы клетки демонстрируют устойчивый колебания для более чем 30 циклов. Для построения более сложных клетки с ядрами, мы добавили demembranated хроматина спермы для самостоятельной сборки вызывают ядер в системе. Мы наблюдали периодических прогрессии хромосома конденсации/decondensation и ядер окутывать разбивка/Реформации, как в реальных клеток. Это означает, что митотическая осциллятор функции добросовестно управлять несколько ниже по течению митотическая события. Мы одновременно отслеживать динамику митотическая осциллятор и технологических процессов в отдельных капель, с помощью микроскопии флуоресцирования многоканальный промежуток времени. Система искусственного клеточного цикла обеспечивает рамки высокой пропускной способностью для количественной обработки и анализа митотическая колебаний с одной ячейкой резолюции, которая вероятно обеспечивает важное понимание механизма регулирования и функции Часы.
Introduction
Цитоплазматическая экстрактов, приготовленные из яиц Xenopus laevis представляют собой один из наиболее основных моделей для биохимического исследования клеток циклов, учитывая большой объем ооцитов, прогрессирование быстрого клеточного цикла и возможность воссоздания Митотическая события в пробирке1,2. Эта система позволила первоначального обнаружения и механистических характеристик регуляторов основных цикла клетки как фактор содействия созревания (MPF), а также течению mitotic процессов, в том числе шпинделя собраний и хромосомы сегрегации1 ,2,3,4,5,6,,78,9,10, 11. Экстракты яйцо Xenopus также были использованы для подробного рассечение регулирования сетей клеточного цикла часов8,12,13,14 и исследования повреждений ДНК /Replication контрольно-пропускного пункта15 и митотического шпинделя Ассамблеи контрольно-пропускного пункта16,17,18.
Эти исследования клеток циклов с использованием экстрактов яйцо Xenopus главным образом были основаны на массовых измерений. Однако реакция обычных массовых анализов не могут имитировать реальные ячейки поведения, учитывая крупные расхождения в их размеры и внутриклеточных пространственной разобщенности реакции молекул. Кроме того измерения массовых митотическая деятельности склонны дать ограниченное количество циклов перед быстро демпфирования8. Эти недостатки массовых реакций помешали экстракт системы для дальнейшего понимания сложных часов динамических свойств и функций. Недавние исследования инкапсулированные клетки бесплатно цитостатическим фактор арестован (CSF) Xenopus извлекает19,20 в определенных размер ячейки как отсеков, которые помогли прояснить, как размер шпинделя модулируется цитоплазматическая объем. Однако эта система в vitro арестован в метафаза мейоз II под действием цитостатического фактор1, и системы, способной долгосрочных устойчивых колебаний на уровне одной ячейки необходим для дальнейшего расследования клеточного цикла осциллятор.
Для изучения клеточного цикла колебаний с одной ячейкой резолюции, мы разработали клетки шкала, высокой пропускной способности системы для растворения и одновременное измерение нескольких хозрасчетных митотическая колебательных процессов в отдельных микроэмульсия капельки. В этом подробные видео-протокол мы продемонстрировать создание системы искусственного митотическая колебание, инкапсулируя Велоспорт Xenopus laevis яйцо цитоплазмы в микроэмульсий размером от 10 до 300 мкм. В этой системе были митотическая колебаний, включая конденсация хромосом де конденсации, ядерная оболочка разбивка и Реформации и деградации и синтез анафазе субстратов (например, securin-mCherry в настоящем протоколе) успешно восстановлена.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представили новый метод для разработки высокопроизводительных искусственных клеток системы, что позволяет в пробирке растворения и долгосрочного отслеживания колебаний хозрасчетных цикла клетки на уровне одной ячейки. Есть несколько важных шагов, которые делают этот метод у…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Lu Мадлен для построения securin mCherry плазмиды, коленях человек ли, Кеннет Хо и Аллен P Лю для дискуссий о поколении капелька, Джереми б. Чанг и Джеймс э. Ferrell Jr для предоставления GFP-NLS построить. Эта работа была поддержана национального научного фонда (начало карьеры Грант #1553031), национальные институты здравоохранения (MIRA #GM119688) и Слоун исследовательских стипендий.
Materials
| Xenopus laevis frogs | Xenopus-I Inc. | ||
| QIAprep spin miniprep kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | QIAGEN | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| BL21 (DE3)-T-1 competent cell | Sigma-Aldrich | B2935 | |
| Calcium ionophore | Sigma-Aldrich | A23187 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Toxic |
| Trichloro | Sigma-Aldrich | 448931 | Toxic |
| (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane | |||
| PFPE-PEG surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads | Sigma-Aldrich | GE17-0756-01 | |
| PD-10 column | Sigma-Aldrich | GE17-0851-01 | |
| VitroCom miniature hollow glass tubing | VitroCom | 5012 | |
| Olympus SZ61 Stereo Microscope | Olympus | ||
| Olympus IX83 microscope | Olympus | ||
| Olympus FV1200 confocal microscope | Olympus | ||
| NanoDrop spectrophotometer | Thermofisher | ND-2000 | |
| 0.4 mL Snap-Cap Microtubes | E&K Scientific | 485050-B | |
| PureLink RNA Mini Kit | ThermoFisher（Ambion） | 12183018A | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Imaris | Bitplane | Version 7.3 | Image analysis software |
References
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
- Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
- Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
- Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
- Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
- Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
- Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
- Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
- Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
- Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
- Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
- Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Wilson, C. M. . Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).
- Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
- Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
- Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
- Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).
