فعالة وقابلة للتمايز الموجهة متوافقة سريرياً القرنية حوفي طلائي الخلايا الجذعية من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية
Summary
ويدخل هذا البروتوكول أسلوب خطوتين بسيطة لتمييز الخلايا الجذعية الظهارية حوفي القرنية من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية تحت ظروف خالية من خلية ثقافة كرة-وتغذية. أساليب الثقافة الخلية المعروضة هنا تمكين إنتاج خلايا نوعية السريرية المنطبق على خلية القرنية العلاج باستخدام فعالة من حيث التكلفة، وعلى نطاق واسع.
Abstract
القرنية حوفي طلائي الخلايا الجذعية () المسؤولة عن تجديد ظهارة القرنية باستمرار، وثم المحافظة على التوازن القرنية والوضوح البصري. الخلية الجذعية pluripotent البشرية (هبسك)-المشتقة توفير مصدر خلية واعدة للعلاج باستبدال الخلايا القرنية. شروط الثقافة والتمايز غير معرف، إكسينوجينيك يؤدي التباين في نتائج البحث وتعوق ترجمة المستمدة من هبسك المداواة السريرية. يوفر هذا البروتوكول أسلوب قابل لإعادة الإنتاج والكفاءة للتمايز هبسك تحت ظروف خالية من خلية كرة-والتغذية. أولاً، ثقافة أحادي الطبقة هبسك غير متمايزة في المؤتلف laminin-521 (LN-521) والمتوسطة هبسك محددة بمثابة أساس لإنتاج قوية انطلاق المواد عالية الجودة للاختلاف. وثانيا، أسلوب المفاضلة هبسك سريعة وبسيطة غلة السكان ليسك في 24 يوما فقط. ويشمل هذا الأسلوب التعريفي الأدمة سطحية أربعة أيام في تعليق مع جزيئات صغيرة، تليها مرحلة الثقافة ملتصقة رابعا LN-521/الكولاجين تركيبة المصفوفة في متوسطة التمايز الظهارة القرنية محددة. كريوستورينج والتمايز الموسعة كذلك ينقي السكان الخلية وتمكن المصارف الخلايا بكميات كبيرة لخلية العلاج بمنتجات. هبسك-عالية الجودة الناتجة عن تقديم استراتيجية علاج رواية محتملة لإعادة بناء سطح القرنية لعلاج نقص الخلايا الجذعية حوفي (جلبتين).
Introduction
يسمح للضوء بالدخول الشبكية القرنية شفافة على سطح العين وتوفر معظم القوة الانكسارية للعين. يتم إعادة إنشاء الطبقة الأبعد، ظهارة القرنية الطبقية، بشكل مستمر بالخلايا الجذعية حوفي الظهارية (). الموجودة في الطبقة القاعدية لمنافذ حوفي1،مفرق كورنيوسكليرال2. ليسكس تفتقر إلى علامات محددة وفريدة من نوعها، حيث هويتهم يتطلب إجراء تحليل أكثر شمولاً لمجموعة من علامات المفترضة. P63 عامل النسخ الظهارية، ولا سيما ن لا شفاء منها مبتوراً نسخة عن isoform ألفا من p63 (ΔNp63α)، وقد اقترح كذات صلة إيجابية ليس علامة3،4. شعبة غير متماثلة من ليسكس يسمح لهم بتجديد نفسها، ولكن أيضا إنتاج ذرية التي تهاجر سينتريبيتالي والأسفل. كما الخلايا تقدم نحو سطح القرنية أنهم تدريجيا تفقد بهم ستيمنيس وأخيراً لا شفاء منها التفريق للخلايا الحرشفية السطحية التي فقدت بشكل مستمر من سطح القرنية.
الأضرار بأي من طبقات القرنية يمكن أن يؤدي إلى إعاقة بصرية شديدة، وعيوب القرنية وبالتالي واحدة من الأسباب الرئيسية لفقدان البصر في جميع أنحاء العالم. في عوز الخلايا الجذعية حوفي (جلبتين)، ليمبوس دمرها المرض أو الصدمة مما يؤدي إلى كونجونكتيفاليزيشن وعتامه سطح القرنية وفقدان الرؤية5،6لاحقاً. ويقدم العلاج استبدال الخلية باستخدام الطعوم حوفي ذاتي أو متمكنة استراتيجية علاج للمرضى الذين يعانون من جلبتين4،7،،من89. بيد أن حصاد ترقيع ذاتي يحمل خطر المضاعفات على العين السليمة والأنسجة المانحة هو نقص في المعروض. يمكن أن الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس)، على وجه التحديد في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسكس) والخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكس)، بمثابة مصدر غير محدود من أنواع الخلايا سريرياً ذات الصلة، بما في ذلك الخلايا الظهارية القرنية. ولذلك، المستمدة من هبسك (هبسك-) تمثل مصدرا خلية جديدة جذابة للعلاج باستبدال خلايا العين.
تقليديا، قد اعتمدت أساليب الثقافة هبسك غير متمايزة وبروتوكوليها التمايز إلى ليسكس على استخدام خلايا تغذية غير معرف أو الأمصال الحيوانية، وسائل الإعلام مشروطة أو أغشية السلي10،11، 12 , 13 , 14 , 15-في الآونة الأخيرة، أدت الجهود المبذولة في اتجاه أكثر أماناً خلية العلاج بمنتجات البحث عن بروتوكولات موحدة وخالية من كرة الثقافة والتمايز أكثر. نتيجة لذلك عدة أساليب محددة وخالية من كرة لثقافة طويلة الأجل من هبسكس غير متمايزة هي الآن متوفرة تجارياً16،،من1718. كسلسلة متصلة، توجيه التمايز بروتوكولات الاعتماد على الرموز الجزيئية لتوجيه هبسكس إلى مصير الظهارة القرنية وقد تم مؤخرا عرض19،،من2021،22، 23. بعد العديد من هذه البروتوكولات المستخدمة أما هبسكس تغذية على أساس غير محدد، كابتداء من مواد، أو زجاجات المعقدة، إكسينوجينيك عامل النمو للتمايز.
والغرض من هذا البروتوكول توفير كرة قوية، محسن،-وأسلوب ثقافة خالية من تغذية هبسك والتمايز اللاحقة إلى القرنية. ثقافة أحادي الطبقة هبسكس pluripotent laminin-521 (LN-521) المصفوفة في هبسك محددة وخالية من الزلال المتوسطة (8 تحديداً الأساسية فليكس) يسمح للإنتاج السريع لمادة انطلاق متجانسة للاختلاف. بعد ذلك أدلة بسيطة، استراتيجية التمايز خطوتين هبسكس تجاه مصير الأدمة السطحية في التعليق، متبوعاً بتمايز ملتصقة على ليسكس. يتم الحصول على عدد سكان خلية حيث أعرب > 65% ΔNp63α خلال 24 يوما. تم اختبار البروتوكول خالية كرة والتغذية مع عدة خطوط هبسك (هيسكس وهيبسكس)، دون أي اشتراط للخلية خط التحسين المحددة. تمكين بروتوكولات phenotyping الصيانة، باساجينج، كريوستورينج وهبسك خالية من عطلة نهاية الأسبوع هنا ووصف إنتاج دفعات كبيرة من عالية الجودة السريرية أو لأغراض البحث.
Protocol
Representative Results
Discussion
والنتيجة المتوقعة من هذا البروتوكول هو توليد ليسكس ناجحة وقوية من تعليق خلية مفردة هبسك فرنك فرنسي خلال أسبوعين تقريبا 3.5. كما يطور ظهارة القرنية من الأديم الظاهر السطحية29، تهدف الخطوة الأولى من البروتوكول التوجيهي هبسكس تجاه هذه النسب. وتستخدم تحريض ح 24 قصيرة مع تحويل عامل ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيده الدراسة أكاديمية فنلندا (رقم المنحة 297886)، وبرنامج قطع الغيار البشرية Tekes، وتمويل الوكالة الفنلندية للتكنولوجيا والابتكار، ومؤسسة مصرف الأنسجة والعين الفنلندية والمؤسسة الثقافية الفنلندية. يشكر المؤلفون فنيي المختبرات الطبية ميلين أوتي وحنا بيكانين فيكشتات أيما هيكيلا أوتي للمساعدة التقنية الممتازة والمساهمة في ثقافة الخلية. أستاذ كاترينا الفأر ألتو-Setälä المسلم لتوفير مرفق “بيوميديتيتش التصوير الأساسية” والخط هيبسك المستخدمة لتوفير المعدات اللازمة للتصوير بالأسفار.
Materials
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
- Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
- Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
- Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
- Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye–a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
- Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
- Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
- Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
- Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).
- Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
- Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
- Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
- Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
- Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).
- Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).
- Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4 (2017).
- Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
- Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).
- Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).
- Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
- International Stem Cell Initiative, , et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286 (2017).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
