Summary

Efficace et évolutive différenciation dirigée de cliniquement compatibles cornéenne limbique épithéliales cellules souches à partir des cellules souches pluripotentes humaines

Published: October 24, 2018
doi:

Summary

Ce protocole présente une méthode simple en deux étapes afin de différencier les cellules souches épithéliales cornéennes limbique de cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture acellulaire xeno – et chargeur. Les méthodes de culture cellulaire présentés ici permettent une production rentable, à grande échelle des cellules qualité clinique applicables à l’utilisation de la thérapie des cellules cornéenne.

Abstract

Cellules souches épithéliales limbique cornée (LESCs) sont responsables de la renouveler en permanence l’épithélium cornéen et maintenant ainsi l’homéostasie cornéenne et une clarté visuelle. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-LESCs dérivées fournissent une source prometteuse de la cellule pour la thérapie de remplacement de cellules cornéennes. Conditions de culture et de la différenciation indéfinies, xénogéniques provoquent des variations dans les résultats de la recherche et entravent la traduction clinique de produits thérapeutiques dérivés de hPSC. Ce protocole prévoit une méthode reproductible et efficace pour la différenciation hPSC-LESC conditions xeno – et chargeur acellulaire. Tout d’abord, culture monocouche de hPSC indifférenciée sur recombinant laminin-521 (LN-521) et moyen défini hPSC sert de base pour une production robuste de haute qualité de matière première pour des différenciations. Deuxièmement, une méthode de différenciation rapide et simple hPSC-LESC donne des populations LESC en seulement 24 jours. Cette méthode comprend une induction surface ectodermique de quatre jours en suspension avec des petites molécules, suivie par phase de culture adhérent sur matrice de combinaison de LN-521/collagène IV dans un milieu défini différenciation épithéliale cornéenne. Cryostoring prolongée différenciation purifie la population cellulaire et permet aux banques de cellules de grandes quantités de produits de thérapie cellulaire. Les qualité qui en résulte hPSC-LESCs fournissent une stratégie de nouveau traitement potentiel pour la reconstruction de surface cornéenne traiter l’insuffisance limbique des cellules souches (LSCD).

Introduction

La cornée transparente à la surface oculaire permet à la lumière d’entrer dans la rétine et fournit la majorité du pouvoir de réfraction de le œil. La couche la plus externe, l’épithélium cornéen stratifié, est continuellement régénérée par les cellules souches épithéliales limbique (LESCs). Les LESCs se trouvent dans la couche basale des niches limbique à la jonction de corneoscleral1,2. LESCs n’ont pas des marqueurs spécifiques et uniques, donc leur identification nécessite une analyse plus approfondie d’un ensemble de marqueurs putatifs. Épithéliales transcription factor p63 et surtout en position N-terminale tronquée transcription de l’isoforme alpha de p63 (ΔNp63α), a été proposé comme une pertinente positive LESC marqueur3,4. Une répartition asymétrique des LESCs permet à se renouveler, mais également produire la progéniture qui migrent de façon centripète et vers l’avant. Comme les cellules des progrès vers la surface de la cornée ils progressivement perdre leurs stemness et enfin faire la différence en phase terminale à des cellules malpighiennes superficielles qui sont constamment perdus de la surface de la cornée.

Dommages à l’une des couches cornéens peuvent mener à la déficience visuelle grave, et défauts cornéens sont donc une des principales causes de cécité dans le monde entier. Dans insuffisance limbique des cellules souches (LSCD), le limbe est détruite par une maladie ou un traumatisme qui mène à conjunctivalization et opacification de la surface de la cornée et la perte de vision5,6. Thérapie de remplacement de cellules à l’aide de greffes limbique autologues ou allogéniques propose une stratégie thérapeutique pour les patients atteints LSCD4,7,8,9. Toutefois, récolte des greffes autologues porte un risque de complications à le œil sain et tissu du donneur est en bref l’approvisionnement. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs), spécifiquement les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs), peut servir comme une source illimitée de types de cellules cliniquement pertinents, y compris les cellules épithéliales cornéennes. Par conséquent, LESCs dérivé de hPSC (hPSC-LESCs) représentent une source de cellule nouveau attrayant pour la thérapie de remplacement de cellules oculaires.

Traditionnellement, des méthodes de culture hPSC indifférencié et leurs protocoles de différenciation à LESCs sont sont appuyés sur l’utilisation de cellules nourricières indéfini, sérums animaux, milieux conditionnés ou membranes amniotiques10,11, 12 , 13 , 14 , 15. récemment, les efforts vers des produits de thérapie cellulaire plus sûrs ont incité la recherche de plusieurs protocoles standardisés et xeno sans la culture et de la différenciation. Par conséquent, plusieurs méthodes définies et xeno-gratuit pour les cultures à long terme des hPSCs indifférencié sont maintenant disponibles dans le commerce16,17,18. Comme un continuum, différenciation dirigée en s’appuyant sur de hPSCs sort épithéliale cornéenne, les repères moléculaires des protocoles ont été récemment introduits19,20,21,22, 23. Encore bon nombre de ces protocoles utilisés soit hPSCs chargeur basé indéfini, comme matériau, ou des cocktails complexes, xénogéniques facteur de croissance pour la différentiation de départ.

Le but du présent protocole est de fournir un robuste et optimisé, xeno- et méthode de culture exempte d’alimentation hPSC et différenciation ultérieure à LESCs cornéens. Culture monocouche de pluripotentes hPSCs sur laminin-521 (LN-521) matrice dans un milieu défini, sans albumine hPSC (notamment essentiels 8 Flex) permet la production rapide de matière homogène de différenciations. Par la suite, un simple, stratégie de différenciation en deux étapes Guide hPSCs vers la surface ectodermique sort en suspension, suivie de différenciation adhérente à LESCs. Une population de cellules où > 65 % express ΔNp63α est obtenue dans les 24 jours. La xéno – et chargeur-un protocole d’entente a été testé avec plusieurs lignes de hPSC (CSEh et hiPSCs), sans aucune obligation pour l’optimisation spécifique de la cellule ligne. Les protocoles pour le week-end-gratuit maintenance, passage, cryostoring et hPSC-LESC phénotypage décrits ici permettent la production d’importants lots de qualité LESCs pour clinique ou des fins de recherche.

Protocol

Université de Tampere a l’approbation de l’autorité nationale pour les affaires médico-légales Finlande (Dnro 1426/32/300/05) de mener des recherches sur les embryons humains. L’Institut a également des déclarations de soutien du Comité éthique du District hospitalier de Pirkanmaa dérivent, culture, et de différentier les lignées de CSEh (Skottman/R05116) et d’utiliser les lignes de hiPSC dans la recherche ophtalmique (Skottman/R14023). Aucune nouvelles lignées de cellules ont été calculées pour ce…

Representative Results

De hPSCs à hPSC-LESCs L’ensemble du processus d’induire la différenciation de FF hPSCs à cryostoring hPSC-LESCs prend environ 3,5 semaines. Figure 1 aprésente un aperçu schématique de la méthode de différenciation mettant en évidence ses principales étapes. Figure 1 b montre une morphologie typique des populations de cellules dans les différentes phases du p…

Discussion

Le résultat escompté de ce protocole est la génération réussie et robuste de LESCs d’une suspension monocellulaire de hPSC FF environ 3,5 semaines. Comme l’épithélium cornéen se développe à partir de l’ectoderme de surface29, la première étape du protocole vise à hPSCs vers cette lignée de direction. Une induction courte 24h avec transformation antagoniste du facteur de croissance bêta (TGF-β) SB-505124 et bFGF sont utilisés pour induire la différenciation ectodermique, sui…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L’étude a été financée par l’Académie de Finlande (numéro de licence 297886), le programme des pièces de rechange humaine de Tekes, l’Agence finlandaise de financement pour la technologie et l’Innovation, le œil finlandais et Tissue Bank Foundation et la Fondation culturelle finlandaise. Les auteurs remercient les techniciens de laboratoire biomédical Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt et Outi Heikkilä excellente assistance technique et de la contribution à la culture cellulaire. Professeur Katriina Aalto-Setälä est reconnu pour prévoyant la fourniture d’équipements pour l’imagerie de fluorescence de la hiPSC ligne utilisée et BioMediTech Imaging Core facility.

Materials

Material/Reagent
1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ Gibco #14040-091
1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ Lonza #17-512F/12
100 mm cell culture dish Corning CellBIND #3296 Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation
12-well plate Corning CellBIND #3336 Culture vessel format for IF samples
24-well plate Corning CellBIND #3337 Culture vessel format for IF samples
2-mercaptoethanol Gibco #31350-010
6-well plate, Ultra-Low attachment Corning Costar #3471 Culture vessel format for induction in suspension culture
Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig ThermoFisher Scientific #A-21202 Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig ThermoFisher Scientific #A-21206 Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 568 anti-goat Ig ThermoFisher Scientific #A-11057 Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig ThermoFisher Scientific #A-10037 Secondary antibody for IF
Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) PeproTech Inc. #AF-100-18B Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution BD Biosciences #554722 Fixation and permeabilization solution for flow cytometry
BD Perm/Wash Buffer BD Biosciences #554723 Washing buffer for flow cytometry
Blebbistatin Sigma-Aldrich #B0560
Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) PeproTech Inc. #120-05A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich #A8022-100G
Cytokeratin 12 antibody Santa Cruz Biotechnology #SC-17099 Primary antibody for IF
Cytokeratin 14 antibody R&D Systems #MAB3164 Primary antibody for IF
Cytokeratin 15 antibody ThermoFisher Scientific #MS-1068-P Primary antibody for IF
CnT-30 CELLnTEC Advanced Cell Systems AG #Cnt-30 Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation
Collagen type IV (human) Sigma-Aldrich #C5533 Human placental collagen type IV
CoolCell LX Freezing Container Sigma-Aldrich #BCS-405
CryoPure tubes Sarsted #72.380 1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation
Defined Trypsin Inhibitor Gibco #R-007-100
Essential 8 Flex Medium Kit Thermo Fisher Scientific #A2858501
GlutaMAX Gibco #35050061
Laminin 521 Biolamina #Ln521 Human recombinant laminin 521
ΔNp63α antibody BioCare Medical #4892 Primary antibody for IF
OCT3/4 antibody R&D Systems #AF1759 Primary antibody for IF
p63α antibody Cell Signaling Technology #ACI3066A Primary antibody for IF
p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) Cell Signaling Technology #56687 p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry
PAX6 antibody Sigma-Aldrich #HPA030775 Primary antibody for IF
Penicillin/Streptomycin Lonza #17-602E
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich #158127 Cell fixative for IF
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific #P36931 DAPI mountant for hard mounting for IF
PSC Cryopreservation Kit Thermo Fisher Scientific #A2644601
TrypLE Select Enzyme Gibco #12563-011
KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco #10829018
KnockOut SR XenoFree CTS Gibco #10828028
MEM non-essential amino acids Gibco #11140050
SB-505124 Sigma-Aldrich #S4696
Triton X-100 Sigma-Aldrich #T8787 Permeabilization agent for IF
VectaShield Vector Laboratories #H-1200 DAPI mountant for liquid mounting for IF
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II Tharmac
Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 BD Biosciences
Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 Olympus

References

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Hongisto, H., Vattulainen, M., Ilmarinen, T., Mikhailova, A., Skottman, H. Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (140), e58279, doi:10.3791/58279 (2018).

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