عكس التحليل التضخيم متحاور حلقة تتوسط النسخ (RT-مصباح) للفيروس Zika والجينات التدبير المنزلي في البول والمصل، وعينات البعوض
Summary
هذا البروتوكول يوفر طريقة فعالة ومنخفضة التكلفة الكشف عن الفيروسات Zika أو التحكم في الأهداف في عينات البول ومصل الدم البشري أو البعوض بالنسخ العكسي بوساطة حلقة متحاور التضخيم (RT-مصباح). هذا الأسلوب لا يتطلب عزل الجيش الملكي النيبالي ويمكن أن يتم في غضون 30 دقيقة.
Abstract
الإصابة بفيروس زكى (زيكف) يمكن أن تكون أعراض عند البالغين، إلا أن العدوى خلال الحمل يمكن أن يؤدي إلى الإجهاض، والتشوهات الخلقية العصبية الحادة. والهدف من هذا البروتوكول بسرعة الكشف عن زيكف في عينات من الإنسان والبعوض. معيار الذهب الحالي للكشف عن زيكف هو النسخ العكسي الكمي PCR (قرة-PCR)؛ عكس النسخ بوساطة حلقة التضخيم متحاور (RT-مصباح) قد تسمح لاختبار أكثر كفاءة وتكلفة منخفضة دون الحاجة إلى معدات مكلفة. في هذه الدراسة، يتم استخدام RT-مصباح للكشف عن زيكف في عينات بيولوجية مختلفة داخل 30 دقيقة، دون الأول عزل الحمض النووي الريبي من العينة. ويتجلى هذا الأسلوب استخدام زيكف إصابة المريض البول والمصل، وإصابة عينات البعوض. الحمض النووي الريبي ريبوسومال 18S واكتين تستخدم كعناصر تحكم في نماذج الإنسان والبعوض، على التوالي.
Introduction
في عام 2015، Zika الفيروسات (زيكف) اكتسبت الاهتمام العالمي البارز كمرض معد للقلق لأنه يرتبط ارتباطاً العدوى خلال الحمل بالإجهاض، الاملاص، والعيوب الخلقية العصبية الحادة بما في ذلك صغر الرأس، فضلا عن سائر خلقي 1من العيوب الخلقية. في حالات نادرة، ارتبطت زيكف بمتلازمة غيان-باريه. زيكف تنتقل أساسا عن طريق بعوض؛ ومع ذلك، فإنه أيضا يمكن أن ينتشر عن طريق الاتصال الجنسي1. نظراً لأن العدوى مع زيكف غير متناظرة في معظم الناس، أو يعرض بأعراض تشبه الإنفلونزا خفيفة تتداخل مع أعراض عدوى أخرى أربورفيروسيس1، كان هناك حاجة لتحسين أساليب الكشف السريع وفعالة من حيث التكلفة من زيكف شاشة كل الناس، فضلا عن السكان المحليين من البعوض.
النسخ العكسي الكمي PCR (قرة-PCR) تحليل موثوق بها للكشف عن زيكف؛ ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب تكلفة المعدات المتخصصة والموظفين المدربين وعزل الحمض النووي الريبي من العينة للفائدة. النسخ العكسي بوساطة حلقة متحاور التضخيم (RT-مصباح) هو أسلوب تضخيم حمض النووي خطوة واحدة تستند إلى تقنية PCR فقط تتطلب درجة حرارة الحضانة واحد نتيجة لاستخدام بوليميراز الدنا لاسخدام مع حبلا خصائص التشرد. هذا تلتف الحاجة ثيرموسيكلير ويقلل من طول الفترة الزمنية اللازمة لإتمام المقايسة. وتشمل المزايا الإضافية RT-مصباح خصوصية عالية وحساسية، ومتانة في طائفة من مستويات الحموضة ودرجات الحرارة، ومقاومة ل مثبطات بكر العديد من2. أنها منخفضة التكلفة نسبيا والكاشفات مستقرة عند درجة حرارة الغرفة. ونظرا لهذه الخصائص، يمكن نشر RT-مصباح في مختبر أو في الميدان. وقد وضعت على هذا النحو، مصباح ردود الفعل للكشف عن مجموعة من العوامل الممرضة وأنواع أخرى من العدوى3،،من45. وهدف البروتوكول RT-مصباح، المذكورة في هذه الورقة الكشف عن زيكف دون عزل الحمض النووي الريبي في البشرية عينات مصل الدم والبول، وكذلك كما هو الحال في بعوضة مصابة واحدة خلال 30 دقيقة عن طريق RT-مصباح. يمكن استخدام هذا الأسلوب لاستبدال قرت-بكر كما هو أداة تشخيصية الحساسة والسريعة التي تعمل بسرعة وفي بيئات خارج المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
الإنزيم زيكف RT-مصباح المبينة في هذه الورقة يعمل استخدام عينات الإنسان والبعوض6. كان الحد الأقصى للكشف عن حوالي 1 الجينوم ما يعادل6، الذي ينبغي أن يكون كافياً نظراً للحمل الفيروسي نموذجية للمريض زيكف المصابين بأعراض 103 إلى 10 مل بفو/6 7….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بتأييد هذا العمل مساهمة الأسرة الخيرية مورين ورونالد هيرش وحقل معهد علوم الأعصاب، سانت ماري في ولاية ميشيغان. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة. كما نشكر الدكتور برناديت زوانس وجناح إيليا لاستعراضها الحرجة من المخطوطة.
Materials
| Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
| MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
| 100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
| Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
| Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
| BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
| Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
| ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
| DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |
References
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).
- Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
- Gandasegui, J., et al. The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).
- Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Lamb, L. E., et al. Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification. Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).
- Faye, O., et al. One-step RT-PCR for detection of Zika virus. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).
- Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).
- Chan, K., et al. Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus. Scientific Reports. 6, 38223 (2016).
- Lee, D., et al. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Priye, A., et al. A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses. Scientific Reports. 7, 44778 (2017).
