逆にジカと尿、血清、蚊のサンプルでハウスキーピング遺伝子の転写-ループ - Lamp 法 (RT ランプ) アッセイ
Summary
このプロトコルは、効率的かつ低コスト ジカのウイルスを検出または逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) で人間の尿や血清のサンプルや蚊のターゲットを制御するメソッドを提供します。このメソッドは、RNA の隔離を必要としないし、30 分以内に行うことができます。
Abstract
ジカ ウイルス (ZIKV) の感染は成人の無症候性することができます、ただし、妊娠中の感染は流産と重度の神経学的な先天性欠損症に 。このプロトコルの目的は、人間と蚊のサンプルで ZIKV を迅速に検出することです。ZIKV 検出のための現在のゴールド スタンダードは定量的逆転写 PCR (qRT PCR);逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) 高価な機器を必要とせずより効率的かつ低コストにテストのため可能性があります。本研究では RT ランプは最初のサンプルから RNA を隔離することがなく 30 分以内のさまざまな生体試料中の ZIKV 検出に使用されます。この手法は、患者の尿、血清、感染し、感染蚊のサンプル ZIKV を使用して示されています。18 s リボソーム リボ核酸とアクチンは、それぞれ人間と蚊のサンプル内のコントロールとして使用されます。
Introduction
2015 年にジカ (ZIKV) 注目を集めて著名なグローバル懸念の伝染病として妊娠中の感染は、流産、死産、重篤な神経学的な出生時欠損など小頭症、その他先天性にリンクされていたので先天性欠損症1。まれに、ZIKV は、ギランバレー症候群に関連付けられています。ZIKV は主にネッタイシマカ蚊; によって送信されます。しかし、それ1性的接触を通して広げることができます。迅速かつコスト効果の高い検出法の改良の必要性があったことを考えると ZIKV 感染は、ほとんどの人に無症候性または他アルボ1の感染症の症状と重なっている軽度のインフルエンザのような症状を呈する、ローカル蚊の個体数と同様、両方の人々 を画面に ZIKV。
定量的逆転写 PCR (qRT PCR) は ZIKV 検出; のための信頼性の高いアッセイです。ただし、この手法には、高価な特殊な装置、訓練された人員および興味のサンプルからの RNA の隔離が必要です。逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) は鎖と耐熱性 DNA ポリメラーゼの使用により 1 つの孵化の温度を必要なだけ PCR 技術に基づくワンステップ核酸増幅法変位プロパティ。これをたちの必要性を回避して試験を完了に必要な時間の長さを減少させます。RT ランプの付加的な利点は、高い特異性と感度、多くの PCR 阻害剤2への抵抗と温度、pH のレベルの範囲で堅牢性を含めます。比較的低コスト、試薬は室温で安定しています。これらの特徴を考えると、実験室やフィールドで RT ランプが展開できます。そのため、病原体や感染3,4、5の他の種類の範囲を検出するランプ反応が開発されています。本稿で記述されている RT ランプ プロトコルの目的は、ひと血清および尿中サンプルでも RT ランプ経由 30 分以内単一感染した蚊のように RNA の隔離なし ZIKV を検出するためです。実験室外側迅速かつ設定で動作する高感度、迅速な診断ツールである qRT PCR を交換するこのメソッドを使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
人間と蚊の両方のサンプル6を使用してこの紙の作品で説明している ZIKV RT ランプの試金。検出限界は約 1 ゲノム等価6、症候性 ZIKV 感染患者の典型的なウイルス負荷は 10 なので十分なする必要があります3 106 Pfu/ml7。さらに、このメソッドは最初の分離する RNA と細胞培養におけるウイルスの増幅なしのサンプル Z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、モーリーンとロナルド ・ ハーシュ家族の慈善的貢献とフィールド神経科学研究所、ミシガン州の聖マリアによって支持されました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。我々 はまた、彼らの重要な原稿のレビュー博士ベルナデット Zwaans とエリヤ病棟をありがとうございます。
Materials
| Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
| MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
| 100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
| Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
| Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
| BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
| Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
| ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
| DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |
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