Zuivering van Low-overvloedig cellen in het visuele systeem van Drosophila
Summary
Hier presenteren we een cel dissociatie protocol voor het efficiënt isoleren van cellen aanwezig bij lage overvloed binnen het visuele systeem van Drosophila door fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS).
Abstract
Recente verbeteringen in de gevoeligheid van de volgende generatie sequencing hebben vergemakkelijkt de toepassing van transcriptomic en genomische analyses op kleine aantallen cellen. Met behulp van deze technologie om te bestuderen van ontwikkeling in het visuele systeem van Drosophila, dat beschikt over een schat aan cel type-specifieke genetische hulpmiddelen, biedt een krachtige aanpak voor het aanpakken van de moleculaire basis van ontwikkeling met precieze cellulaire resolutie. Voor een dergelijke aanpak niet haalbaar, is het van cruciaal belang dat de capaciteit voor het betrouwbaar en efficiënt zuiveren cellen aanwezig bij lage overvloed binnen de hersenen. Hier presenteren we een methode waarmee de efficiënte reiniging van eencellige klonen in genetische mozaïek experimenten. Met dit protocol consequent we een cellulaire lucratieve na zuivering met behulp van fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS) (~ 25% van alle gelabelde cellen), en met succes uitgevoerd transcriptomics analyses op eencellige klonen gegenereerd via mozaïek analyse met een repressible cel marker (MARCM). Dit protocol is ideaal voor het toepassen van transcriptomic en genomische analyses op specifieke celtypes in het visuele systeem, in verschillende stadia van ontwikkeling en in het kader van verschillende genetische manipulaties.
Introduction
Het visuele systeem van Drosophila is een uitstekend model voor het bestuderen van de genetische basis van ontwikkeling en gedrag. Het omvat een stereotiepe het cellulaire platform1 en een geavanceerde genetische toolkit voor het manipuleren van specifieke cel typen2,3. Een belangrijke troef van dit systeem is de mogelijkheid om autonoom ondervragen genfunctie in celtypes van belang met eencellige resolutie, met behulp van genetische mozaïek methoden4,5. Wij willen deze genetische hulpmiddelen combineren met recente vooruitgang in volgende generatie rangschikken uit te voeren van cel type-specifieke transcriptomic en genomische analyses in één cel gekloond in genetische mozaïek experimenten.
Om dit te bereiken, is het essentieel een robuuste en efficiënte methode om selectief isoleren lage overvloedige cel populaties in de hersenen te ontwikkelen. Eerder, ontwikkelden we een protocol voor het isoleren van specifieke celtypes in het visuele systeem tijdens de ontwikkeling van de pop via FACS, en het vaststellen van hun transcriptomes met RNA-seq6. De overgrote meerderheid van de cellen van een bepaald type (bijvoorbeeld R7 researchdieren) waren in deze experimenten, fluorescently gelabeld. Met behulp van deze methode in genetische mozaïek experimenten, waarin slechts een subset van cellen van hetzelfde type worden aangeduid, verzuimd wij te isoleren voldoende cellen om kwaliteit rangschikken gegevens te verkrijgen. Om aan te pakken dit, willen wij de cellulaire opbrengst verhogen door het verbeteren van de cel dissociatie protocol.
Onze benadering was te verminderen van de totale lengte van het protocol bij het maximaliseren van de gezondheid van gedissocieerde cellen, verbetering van de cellulaire gezondheid door een wijziging van de dissectie en dissociatie buffers, en verminderen de hoeveelheid mechanische verstoring van het ontleed weefsel. We testten de verbeterde protocol7 mozaïek analyse met een repressible cel marker5 (MARCM), waarmee de generatie van single fluorescently label klonen van bepaalde celtypen, die wild type of mutant voor een gen van belang in een anders heterozygoot vliegen. Wanneer onder identieke omstandigheden, niet onze eerdere protocol genereren genoeg materiaal voor RNA-seq, was het verbeterde protocol succesvol. We reproducibly bereiken van een hoge cellulaire opbrengst (~ 25% van gelabelde cellen) en gegevens van de RNA-seq van hoge kwaliteit te verkrijgen van zo weinig als 1000 cellen7.
Een aantal protocollen zijn eerder beschreven om te isoleren van bepaalde celtypen in Drosophila6,–8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. deze protocollen zijn vooral bestemd voor het isoleren van cellen die overvloedig in de hersenen zijn. Ons protocol is geoptimaliseerd voor het isoleren van lage overvloedige cel populaties (minder dan 100 cellen per hersenen) in het visuele systeem met behulp van FACS voor latere transcriptomic en genomische analyses. Met dit protocol streven we naar een manier om reproducibly isoleren van lage overvloedige cellen uit het vliegen visuele systeem door FACS en het verkrijgen van hoge kwaliteit transcriptome gegevens door RNA-seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is eenvoudig en niet technisch moeilijk uit te voeren, maar er zijn verschillende sleutel stappen die als over het hoofd gezien zal leiden tot een aanzienlijke vermindering in cellulaire opbrengst. (Stap 2.3.2.) Het is cruciaal dat kruisen gezond zijn, en dat het voedsel droogt niet uit. Regelmatig water geven van kruisen is essentieel voor het maximaliseren van het aantal vliegen beschikbaar voor dissectie die van de juiste genotype en in de juiste fase van ontwikkeling zijn. Hoe vaak kruisjes moeten worden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door de NINDS van de National Institutes of Health award onder nummer K01NS094545, andgrants van de Lefler centrum voor de studie van neurodegeneratieve aandoeningen. Wij erkennen bekalking Tan en Jason McEwan voor waardevolle gesprekken.
Materials
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
