Summary

ショウジョウバエ視覚系における低豊富な細胞の浄化

Published: September 26, 2018
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Summary

ここでは、効率的に細胞蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えをショウジョウバエ視覚系内低豊富で存在を隔離するための細胞解離プロトコルを提案する.

Abstract

次世代シークエンシングの感受性の最近の改善はトランスクリプトームとゲノム解析の少数のセルへの適用を容易にしました。携帯型固有の遺伝的ツールの富を誇るショウジョウバエ視覚系における開発にこの技術を活用した正確な携帯電話の解像度を持つ開発の分子基盤に対処するための強力なアプローチを提供します。このようなアプローチ可能であること、確実かつ効率的に細胞脳内低豊富で存在を浄化する能力を持っていることが重要です。遺伝のモザイク実験単一細胞のクローンの効率的な精製ができる方法を紹介します。このプロトコルで一貫して実現高収率の細胞蛍光を用いた浄化セル (FACS) (ラベルのすべてのセルの ~ 25%) を並べ替えをアクティブ化してによって生成された単一のセル複製のトランスクリプトーム解析を正常に実行モザイク解析抑制型細胞のマーカー (MARCM)。このプロトコルは、特定の細胞型へのトランスクリプトームとゲノム解析を開発と異なる遺伝的操作のコンテキストでのさまざまな段階で視覚システムの適用に最適です。

Introduction

ショウジョウバエ視覚系は、発達や行動の遺伝的基盤を研究するための優れたモデルです。ステレオタイプ化された細胞アーキテクチャ1と特定のセル型2,3を操作するための高度な遺伝子のツールキットを装備されています。このシステムの主要な強さは、自律的遺伝的モザイク メソッド4,5を使用して、単一のセル解像度に目的のセル型で遺伝子の機能を調べる機能です。我々 はこれらの遺伝学的ツールを組み合わせてセル型固有トランスクリプトームを実行する次世代シーケンシングの最近の進歩しようし、単一細胞でゲノム解析の遺伝的モザイク実験でクローンを作成します。

これを行うには、脳内低豊富な細胞集団を選択的に分離する堅牢で効率的な手法の開発が不可欠です。以前は、FACS、によって蛹の発育中に視覚系における特定の細胞型を分離し、RNA シーケンス6を使用して彼らのトランスクリプトームを決定するためのプロトコルを開発しました。これらの実験で (例えばR7 視細胞) 特定のタイプの細胞の大半は蛍光標識しました。前記同じ種類の細胞のサブセットだけがラベル付けされて、遺伝のモザイクの実験でこのメソッドを使用して我々 は品質シーケンス データを取得するのに十分な細胞を分離できませんでした。これに対処するため、我々 は細胞解離プロトコルを改善することによって細胞の収穫を増加する求めた。

我々 のアプローチは、解離細胞の健康を最大限、解離と解離のバッファーを変更することにより細胞の健康を改善するためのプロトコルの合計の長さを減少させ、切り裂かれたティッシュの機械停止の量を減らすことだった。我々 はモザイク解析を用いた抑制型セル マーカー5 (MARCM)、野生型かの興味の遺伝子の突然変異体をある特定のセル型のクローンを蛍光標識する単一の生成を可能にする改善された議定書7をテストします。それ以外の場合をヘテロ飛ぶ。ここで、同一条件の下で私たちの以前のプロトコルは RNA シーケンスの十分な材料を生成する失敗、改良されたプロトコルに成功しました。私たちは再現性をもって高細胞収率 (標識細胞の ~ 25%) を達成するため、1,000 ほどの細胞7から高品質 RNA シーケンス データを得ます。

いくつかのプロトコルはショウジョウバエ6,8,9,1011,12,13種類の特定のセルを隔離する以前記載されています。,14,15,16します。 これらのプロトコルは脳の中で豊富な細胞を分離、大抵。我々 のプロトコルは、その後トランスクリプトームとゲノム解析の FACS を用いた視覚システムで低豊富な細胞集団 (脳あたりより少ない 100 細胞) を分離することに最適です。このプロトコルでは、再現性をもって FACS と RNA シーケンスによる高品質トランスクリプトーム データの取得によってフライ視覚系から低豊富な細胞を分離する方法を提供を目指してください。

Protocol

1. 実験前に計画 実験を開始する前に遺伝学特に任意のセルのラベルに期待どおりに動作を確認するため小規模な試験を実行します。 最初のパス、使用免疫組織化学どうを光学顕微鏡と不必要なセルのラベルです。理想的には、遺伝子マーカーは、視葉 (図 3)、網膜内の特定になります。のみ視葉が細胞解離のため使用され、ので中央の脳で?…

Representative Results

一般的な方式プロトコルの一般的なスキームを図 1に示します。プロトコルは 3 つの主要な部分に分かれています: 作業、サンプル準備、シーケンシングおよびデータ解析を飛ぶ。わかりやすくするための一般的な方式では、プロトコルの「実験前に計画」セッションは含まれません。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1…

Discussion

このプロトコルはシンプルで、実行する技術的に困難ではないが、いくつかの重要なステップの意志を見落としている場合があります携帯電話の収量がかなり低下します。(ステップ 2.3.2。)十字架は、健康と食べ物が乾かないことが重要です。十字の定期的な散水は、ハエは、開発の適切な段階では、右の遺伝子型の郭清可能数を最大化するために不可欠です。どのくらいの頻度をまかれる?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、賞を受賞番号 K01NS094545、神経変性疾患研究センター ・ レフラーから切り替えたの下健康の国民の協会の NINDS によって賄われていた。我々 は、貴重な会話のため石灰タンとジェイソン マキューアンを認めます。

Materials

Liberase TM Roche 5401127001 Proteolytic enzyme blend
NaCl Sigma-Aldrich S3014
KCl Sigma-Aldrich P9541
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich  S5761
Glucose Sigma-Aldrich G0350500
L-Glutathione Sigma-Aldrich G6013
Heat Inactivated Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135
Insulin Solution Sigma-Aldrich I0516
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513
Penicillin-Streptomycin Solution Sigma-Aldrich P4458
Schneider's Culture Medium Gibco 21720024
Papain Worthington LK003178
2-Mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA purification kit
RNase-free DNase Qiagen 79254
SuperScript II Reverse Transcriptase Life Technologies 18064-014
dNTP Mix Life Technologies R0191
MgCl2 Solution Sigma-Aldrich M1028-10X1ML
Betaine Solution Sigma-Aldrich B0300-1VL
RNaseOUT Life Technologies 10777-019
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix New England Biolabs M0492S
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004
Nextera XT DNA Library Prepration Kit Illumina FC-131-1024
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-1001
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap Falcon 352235
Bottle-Top Vacuum Filter Systems Corning CLS431153
ThermoMixer F1.5 Eppendorf 5384000020
FACSAria Flow Cytometer BD Biosciences 656700
HiSeq 2500 Sequencing System Illumina SY–401–2501

References

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Cite This Article
Peng, J., Santiago, I. J., Pecot, M. Y. Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System. J. Vis. Exp. (139), e58474, doi:10.3791/58474 (2018).

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