我们描述了一种利用人血清、原代人细胞以及实时定量聚合酶链式反应进行感染定量的方法，用于评估针对登革病毒的预存免疫对寨卡病毒感染的影响。
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本文内容
摘要
摘要
寨卡病毒（Zika virus）作为一种黄病毒属新发病毒，其感染与吉兰-巴雷综合征及婴儿小头症等神经系统并发症相关，已引发严重的公共卫生安全问题。在诸多风险因素中，抗体依赖性增强作用（antibody-dependent enhancement, ADE）构成最显著的威胁，因为寨卡病毒（ZIKV）的近期再次暴发主要发生在人群既往已暴露于其他密切相关黄病毒（尤其是登革病毒，DENV）并处于预存免疫状态的地区。本文介绍一种用于定量评估人血清中抗登革病毒（DENV）抗体对寨卡病毒（ZIKV）在原代人细胞或细胞系中感染效果影响的实验方案。
引言
在蚊媒传播的病毒性疾病中，寨卡病毒感染是临床上最为重要的疾病之一1。该感染由黄病毒属的寨卡病毒（ZIKV）引起，在大多数情况下以埃及伊蚊（Aedes aegypti）为主要传播媒介1,2。然而，已有研究报道在某些寨卡病毒暴发疫情中，白纹伊蚊（Aedes albopictus）亦可作为主要传播媒介3。尽管许多感染者无明显症状，最常见的临床表现仍为发热、头痛和肌肉疼痛2。目前尚无针对寨卡病毒感染的特效治疗方法或疫苗，临床上主要采取支持性治疗。近年来南美洲暴发的寨卡病毒疫情导致了大量重症病例，并使胎儿神经发育障碍——小头症（microcephaly）的发生率上升约20倍2。由于南美洲是登革病毒（DENV）和西尼罗病毒等多种虫媒病毒的流行区域，因此亟需研究机体对其他黄病毒的既往免疫是否会影响寨卡病毒感染的严重程度和疾病进程。
在漫长的进化过程中，病毒发展出多种策略以提高其感染能力，从而劫持宿主细胞的生物机制并抑制抗病毒反应。其中最引人注目的策略之一是病毒利用宿主的先天免疫抗体，通过抗体依赖性增强（ADE）现象来促进自身复制
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方案
本研究中使用的血清样本来自哥伦比亚一个队列的人类受试者。样本采集已获得哥伦比亚南美洲帕姆普洛纳大学（Universidad de Pamplona）和洛斯波蒂奥斯医院（Los Potios Hospital）伦理审查委员会（IRB）的批准。8样本为匿名提供，研究人员无法获取患者信息。血清样本经检测确定登革病毒（DENV）血清型，并进一步确认其可中和DENV感染。 体外 作为对照，使用来自美国的健康个体（HC）的血清样本。
注意：本方案可用于研究在表达 Fcγ 受体的任何人类细胞类型中寨卡病毒（ZIKV）复制的抗体依赖性增强（ADE）效应。该方案包括三个部分（图1）。
1. 细胞接种与感染设置
注意：本研究使用人原代巨噬细胞或U937髓单核细胞系（ATCC-CRL-1593.2）。细胞培养于添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中，在37 °C、含5%二氧化碳（CO2）的培养箱中孵育。所有操作均在生物安全二级（BSL-2）生物安全柜中的无菌条件下进行。
- 接种 3 × 104 每孔加入100 µL培养基，在....
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结果
在图1中，逐步以示意图形式展示了执行ADE实验方案的全部步骤。该图是由于既往存在登革病毒（DENV）免疫而引发寨卡病毒（ZIKV）ADE效应的完整流程示意图。图2展示了人血清样本如何被分为三组：经登革病毒感染确认的样本称为DENV感染组，经登革病毒抗体确认的样本称为DENV暴露组，而无登革病毒中和抗体或RNA的健康个体血清则称为健康对照（HC）组。（图2）
将所有血清样本与寨卡病毒（ZIKV）孵育形成复合物后，用于感染巨噬细胞。感染后48小时，提取RNA并进行qRT-PCR分析。图3所示的代表性实验表明，含有登革病毒（DENV）血清型1至4抗体的大多数血清均能在不同程度上增强ZIKV的复制。与血清型1和3相比，含有D.......
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讨论
登革病毒（DENV）抗体的交叉反应性导致其他DENV血清型的抗体依赖性增强（ADE），这阻碍了有效疫苗的开发11。寨卡病毒（ZIKV）属于同一科，即黄病毒科（Flaviviridae），与其他黄病毒尤其是DENV具有较高的同源性12。ZIKV和DENV中和抗体的主要靶标均为包膜蛋白，该蛋白在两种病毒之间具有极高的结构和四级序列同源性13,14,15。已有研究表明，对DENV或ZIKV的预先免疫可增强另一种病毒的感染能力8,16。
在 ADE 实验中，有多种不同的方法用于量化病毒的感染性，包括蚀斑实验17、使用荧光染料标记抗体进行细胞内病毒抗.......
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本工作获得了1R21AI129881-01（资助对象：T.M.C.）、国家新发传染病实验室的启动资金以及波士顿大学医学院的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胎牛血清 | GEMINI | 100-106 | |
| iCycler | BioRad | 785BR02188 | 型号 CFX96 光学模块 |
| Microfuge 18 离心机 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Nanodrop-1000 | Thermoscientific | 1072 | |
| Quantifast SYBR-One step RT-PCR 试剂盒 | Qiagen | 204154 | 用于一步法 RT-qPCR |
| RNeasy RNA 提取试剂盒 | Qiagen | 74106 | 用于 RNA 提取 |
| RPMI 培养基 | Gibco | 11875093 |
参考文献
- Hayes, E. B. Zika virus outside Africa. Emerging Infectious Diseases. 15, 1347-1350 (2009).
- Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) - 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), ....
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