Создание линий клеток, экспрессирующих DR3 оценить ответ Apoptotic анти митотическая терапии
Summary
Создание стабильной клеточная линия, экспрессирующих ген интереса для изучения функции гена могут быть сделаны стабильной трансфекции рудоразборка одного клонов после transfecting их через ретровирусной инфекции. Здесь мы покажем, что HT29-DR3 клеточных линий, созданных таким образом выяснить какой смертью рецептор 3 (DR3) способствует antimitotics индуцированного апоптоза механизмов.
Abstract
Изучая функции гена интереса может быть достиган манипулирования ее уровень выражения, например сокращения его выражение с нокдаун клеточных линий или увеличения его выражение с гиперэкспрессия клеточных линий. Переходных и стабильной трансфекции являются два метода, которые часто используются для выражения экзогенных генов. Переходных трансфекции полезен только для краткосрочных выражение, тогда как стабильная трансфекции позволяет экзогенных генов быть интегрированы в геном клетки принимающей где он будет выражаться непрерывно. В результате стабильной transfection обычно используется для исследования в долгосрочной генетического регулирования. Здесь мы опишем простой протокол для создания строки стабильной клеток, экспрессирующих Помеченный смертью рецептор 3 (DR3) для изучения DR3 функции. Мы выбрали один клонов после ретровирусной инфекции для поддержания однородности и чистоты стабильных клеточных линий. Стабильных клеточных линий, созданных с помощью этого протокола оказывают DR3-недостаточным HT29 клеток чувствительных к antimitotic препаратам, таким образом воссоздания апоптотической реакции в HT29 клетках. Кроме того тег флаг на DR3 компенсирует отсутствие хороших DR3 антитела и облегчает биохимические исследования молекулярный механизм, по которому antimitotic агентов индуцировать апоптоз.
Introduction
Экспрессии гетерологичных генов часто используется для изучения функции генов интерес. Два метода, переходных и стабильной трансфекции, преимущественно используются в клетки и молекулярной биологии для вставки сегмент ДНК или РНК в принимающей ячейки1,2. Временно transfected ДНК или РНК не может быть передана дочь клетки, поэтому генетические изменения могут храниться только на короткий период времени. С другой стороны в стабильно transfected клеток, экзогенных генов интегрированы в геном клетки хост, поддержания ее выражение в ячейку строки. Таким образом стабильной трансфекции является метод, который обычно резервируется для исследования долгосрочных генетического регулирования. Стабильные клеток линии также могут быть трансплантированы, как ксенотрасплантатов в модели мыши в vivo исследования3. Трансфекция стабильная можно разделить на две категории: вирусные и синцитиального. По сравнению с синцитиального трансфекции, вирусные инфекции могут передавать гены в более широкий спектр человеческих клеток с более высокой эффективности4,5,6,7. Кроме того стабильные клеточная линия от одного клона предлагает преимущество клоновых чистоты и однородности.
Неконтролируемое клеточный рост и деление являются наиболее отличительные черты рака. В клинических условиях antimitotic агенты являются первичного лечения для многих типов опухолей8. Однако нельзя игнорировать некоторые существенные ограничения antimitotic агентов. Во-первых эти химиотерапии может убить нормальные клетки вместе с нежелательным раковых клеток и, таким образом, может привести к серьезным побочным эффектам8. Во-вторых, антитубулиновые наркотики не являются эффективными против всех типов опухолей, несмотря на повсеместно тубулина в выражение в широкий спектр различных тканей как белок цитоскелета9,10. Неясно, почему антитубулиновые агентов показали многообещающие эффективность против яичников, лёгких и гематологические опухоли в клинического лечения, но не в почки, толстой кишки или рак поджелудочной11. Наконец даже пациенты с тем же типом опухоли может реагировать на antimitotics по-разному непредсказуемым образом. Там может быть ключевым эффекторные молекулы, которая влияет на чувствительность разных пациентов antimitotic агентов, что приводит к различных результатов, видели в клинического лечения12. Таким образом потенциальные дифференциального чувствительности больных к antimitotic лечению должны учитываться для того чтобы оптимизировать терапевтических вмешательств13.
Экран Библиотека высок объём всего генома siRNA продемонстрировал, что DR3 нокдаун может сделать чувствительные клетки устойчивы к antimitotic препаратам, подразумевающие роль для DR3 в химиотерапии индуцированного апоптоза14. Будучи членом надсемейства фактор некроза опухоли рецепторов (TNFR) сообщалось DR3 посредником апоптоз клеток в различных системах15,16,17,18. Таким образом мы отправились для установления стабильных клеточных линий, экспрессирующих DR3 изучение молекулярных механизмов, которые antimitotic наркотиков индуцировать апоптоз. Соответствующие ячейки модель для изучения DR3 гиперэкспрессия может обеспечиваться линии клетки рака толстой кишки человека HT29, который оказался DR3-недостаточным. Кроме того, в клинике рака толстой кишки не чувствительны к antimitotic препараты19.
В этой статье мы описываем метод, который позволяет генерировать стабильные клеточной линии HT29-DR3 через ретровирусной инфекции. Далее мы покажем, как проверить DR3 выражение в этих клетках, используя Западный blotting и как оценить чувствительность к antimitotic агентов, используя assay жизнеспособности клетки и морфологических наблюдения. Клетки усиливаются от одного клонов и, таким образом, имеют преимущество однородной генетический фон. Кроме того флаг метки на DR3 допускается для визуализации клеточных DR3 микроскопии и анализа взаимодействия выражения и белка гена путем биохимических подходов. Кроме того клетки может быть xenografted в мышах для дальнейшего анализа опухолевой прогрессии в ответ на antimitotics в vivo14.
Система HT29-DR3 клеток, представленные здесь предложили эффективным инструментом для изучения молекулярных механизмов как antimitotics убить клетки рака14. Поскольку общие инструменты для изучения функции гена гиперэкспрессия и бросовым клеточных линий, этот протокол можно легко адаптировать для других генов интерес или другие клеточные линии и, таким образом, превратилась в широко используется подход.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи мы описываем метод для создания HT29-DR3 стабильных клеточных линий. HT29-DR3 клетки обеспечивают модель для изучения молекулярных механизмов, которыми DR3 способствует апоптоз, antimitotic агентов. Этот подход является универсальным и повторяемости. Для обеспечения успеха процедур…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана от грантов 53110000117 (чтобы G.W.) и 043222019 (для X.W.) из университета Цинхуа.
Materials
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | |||
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q. Animal models of BCR/ABL-induced leukemias. Leukemia & Lymphoma. 11, 57-60 (1993).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry – Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R. Transfection by electroporation. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
