Establecimiento de líneas de células Overexpressing DR3 para evaluar la respuesta apoptótica a la terapéutica anti-mitotic
Summary
Estableciendo una línea estable de células overexpressing un gen de interés para el estudio de funciones de los genes puede hacerse estables recogida de transfección clones solo después de la transferencia de ellos a través de la infección retroviral. Aquí mostramos que las líneas de celulares HT29-DR3 generadas de esta manera dilucidar los mecanismos por el cual la muerte receptor 3 (DR3) contribuye a la apoptosis inducida por antimitotics.
Abstract
Estudiar la función de un gen de interés se logra mediante la manipulación de su nivel de expresión, como su expresión con líneas celulares de sobreexpresión de aumentando o disminuyendo su expresión con líneas celulares de precipitación. Transfección transitoria y estable son dos métodos que se utilizan para la expresión de genes exógenos. Transitorios de la transfección sólo es útil para la expresión a corto plazo, mientras que la transfección estable permite genes exógenos a integrarse en el genoma de la célula huésped donde se se expresa continuamente. Como resultado, la transfección estable se emplea generalmente para la investigación en regulación genética a largo plazo. Aquí describimos un protocolo simple para generar una línea celular estable overexpressing muerte etiquetado receptor 3 (DR3) para explorar la función DR3. Seleccionamos clones solo después de una infección retroviral para mantener la homogeneidad y la pureza de las líneas celulares estables. Las líneas celulares estables generadas mediante este protocolo representan células HT29 DR3-deficiente sensibles a drogas antimitótica, reconstituyendo así la respuesta apoptótica en células HT29. Además, la etiqueta de la bandera en DR3 compensa la falta de buena anticuerpo DR3 y facilita el estudio bioquímico del mecanismo molecular por el cual agentes antimitótica inducen apoptosis.
Introduction
Expresión de genes heterólogos se emplea a menudo para estudiar la función de los genes de interés. Dos métodos, transfección transitoria y estable, se utilizan predominantemente en las células y biología molecular para insertar un segmento de ADN o ARN en un anfitrión célula1,2. Transitorio transfected ADN o ARN no puede transmitirse a células de la hija, por lo que la alteración genética puede conservarse sólo durante un período corto de tiempo. Por otra parte, en las células transfected estable, genes exógenos se integran en el genoma de la célula anfitrión, mantener su expresión en la línea celular. Así, la transfección estable es un método que generalmente se reserva para la investigación en la regulación genética a largo plazo. La línea celular estable también puede trasplantarse como xenoinjertos en modelos de ratón in vivo de estudio3. Transfección estable puede dividirse en dos categorías: virales y nonviral. En comparación con transfección nonviral, infección viral puede transferir genes en una variedad más amplia de células humanas con una mayor eficiencia4,5,6,7. Además, una línea celular estable de un solo clon ofrece la ventaja de la homogeneidad y pureza clonal.
División y crecimiento incontrolados de células son las más características del cáncer. En ajustes clínicos, agentes antimitótica son los tratamientos principales para muchos tipos de tumores8. Sin embargo, no se puede ignorar algunas limitaciones significativas de agentes antimitótica. En primer lugar, estas quimioterapias también pueden matar a las células normales junto con las células cancerosas no deseadas y, por lo tanto, pueden resultar en efectos secundarios graves8. Segundo, antitubulin medicamentos no son eficaces contra todos los tipos de tumores, a pesar de expresión ubicua de la tubulina en una amplia variedad de diferentes tejidos como una proteína citoesquelética9,10. No está claro porqué antitubulin agentes mostraron eficacia prometedora contra el ovario, pulmón y cánceres hematológicos en el tratamiento clínico, pero no en riñón, colon y los cánceres de páncreas11. Por último, incluso los pacientes con el mismo tipo de tumor pueden responder a las antimitotics diferentemente de una manera impredecible. Puede haber una molécula efectora clave que afecta a la sensibilidad de diferentes pacientes a agentes antimitótica, dando por resultado los diversos resultados en el tratamiento clínico12. Por lo tanto, la potencial sensibilidad diferencial de los pacientes al tratamiento antimitótica debe tenerse en cuenta para optimizar las intervenciones terapéuticas13.
Una pantalla de biblioteca de siRNA de todo el genoma de alto rendimiento demostró que DR3 caída puede hacer sensibles células resistentes a drogas antimitótica, implicando un papel para DR3 en la apoptosis inducida por la quimioterapia14. Como miembro de la superfamilia de receptores (TNFR) factor de necrosis tumoral, DR3 se ha divulgado para mediar la apoptosis de las células en varios sistemas15,16,17,18. Así pues, nos propusimos establecer líneas celulares estables overexpressing DR3 para estudiar los mecanismos moleculares por el cual droga antimitótica induce apoptosis. Un modelo de celular adecuado para el estudio de sobreexpresión de DR3 se puede proporcionar por la línea de celular del cáncer de colon humano HT29, que fue encontrado para ser DR3-deficiente. Además, en la clínica, cánceres de colon son insensibles a fármacos antimitótica19.
En este artículo, describimos un método que permite la generación de una línea celular estable de HT29-DR3 a través infección retroviral. Además mostramos cómo validar la expresión DR3 en estas células mediante western blot y cómo evaluar la sensibilidad a agentes antimitótica mediante un análisis de viabilidad de la célula y la observación morfológica. Las células son amplificadas de clones individuales y, por lo tanto, tienen la ventaja de un fondo genético homogéneo. Además, la etiqueta de la bandera en DR3 permitido para la visualización de DR3 celular por microscopia y análisis de la gene expresión y proteína interacción por métodos bioquímicos. Además, las células pueden ser investigaciones en ratones para analizar la progresión del tumor en respuesta a antimitotics en vivo14.
El sistema de células HT29-DR3 presentado aquí ofrece una herramienta efectiva para estudiar los mecanismos moleculares de cómo antimitotics matar células de cáncer14. Puesto que la sobreexpresión y líneas celulares de precipitación son herramientas comunes para estudiar la función genética, este protocolo puede ser adaptado fácilmente a otros genes de interés o de otras líneas celulares y, así, se convirtió en un método ampliamente utilizado.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este manuscrito, se describe un método para generar líneas de células estables de HT29-DR3. Las células HT29-DR3 son un modelo para el estudio de los mecanismos moleculares por los cuales DR3 contribuye a la apoptosis inducida por agentes antimitótica. Este enfoque es versátil y repetible. Para garantizar el éxito del procedimiento, cuatro pasos claves del protocolo necesitan ser considerados. En primer lugar, con el fin de producir un alto suficiente título de virus, se recomienda realizar la transfección de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de 53110000117 (a GW) y 043222019 (a X.W.) de la Universidad de Tsinghua.
Materials
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | |||
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
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