לוציפר צהוב-מרקר חזק הקרנף מסמן במודל תא של מכשול הדם האנושי-מוח
Summary
אנו מציגים שיטת הזריחה כדי להדגים כי לוציפר הצהוב (LY) הוא סמן חזק כדי לקבוע את החדירות הפראוטיות לכאורה של המונטמקים/D3 cell monolayers, מודל בלתי מתורבת של מחסום הדם-מוח האנושי. השתמשנו בקביעה זו כדי לקבוע את הקינטיקה של היווצרות מונאולייר מתורבת בתאי מימן מונולימקים/D3.
Abstract
המכשול המוחי-דם BBB מורכב מתאי האנדותל היוצרים מחסום בין הסירקולציה הסיסטמית למוח כדי למנוע חילופי יונים לא חיוניים וחומרים רעילים. צמתים הדוקים (TJ) לאטום ביעילות את החלל הפאראתאי במונאולאיירס וכתוצאה מכך מכשול שלם. מחקר זה מתאר באופן מבוסס ביותר מבוססת על הקרינה הפלואורסצנטית כי ניתן להשתמש כדי לקבוע מקדם חדירות לכאורה שלה (Papp) ובתורו יכול לשמש כדי לקבוע את הקינטיקה של היווצרות של מונואולאיירס conol, ואת הצומת ההדוק שנוצר שלמות המכשול בבכצ/D3 מונאולאיירס. אנו עוד להדגים כלי נוסף של הספק הזה כדי לקבוע את השלמות הפונקציונלית TJ בתאים מזוהמים. הנתונים שלנו מ-LY Papp האפליקציה מראה כי ההטיות/D3 תאים שנזרע בהתקנה transwell ביעילות להגביל באופן מוגבל הובלה בלבד 7 ימים-הודעה התרבות. ככלי נוסף של התשובה המוצגת, אנו גם להדגים כי ה-DNA ננו-חלקיק הזיהום אינו משנה את התחבורה הקרנף לולי ב-Hmec/D3 monolayers.
Introduction
מחסום דם-מוח (BBB) הוא מכשול ההגנה המגביל את זרם רכיבי הפלזמה לתוך רקמת המוח ומורכב מתאי המוח המתכלים יחד עם תאים תומכים כגון קרום הלב. התפקיד העיקרי של bbb הוא לשמש מחסום כי חותמות את החלל בין דם היקפי מערכת העצבים המרכזית (cn) כדי לשמור על הומוסטאזיס של המיקרוסביבה העצבית1,2. מוחו של נימי המוח מתאים באופן יעיל את מסלול הקרנף באמצעות היווצרות הצמתים הצמודים הבינתאיים (TJs)1. מכשול הגנה זה מאפשר גלוקוז וחומרים מזינים שנבחרו להיכנס למוח בזמן שהוא מונע את רוב היונים, חומרים רעילים ותרופות לעבור דרך מכשול זה צר. מלבד תפקידה המגן, תפקוד המכשול הטבעי של BBB מהווה אתגר חמור בפיתוח מערכות משלוח הסמים מיקוד ה-CN.
במודלים של תרבות תא מתורבת של BBB הם כלים שימושיים ללמוד את הביולוגיה שלה להבין את ההשפעות של טיפול תרופתי על שלמות המכשול TJ. השתמשנו בחוט הטלפון האנושי של מיקרוכלי-הדם של המוח (מימן/D3) כמודל להפריה חוץ-גופית, כיוון שהוא מודל מקובל של שלוש המוחות האנושיים ולאחר מכן פונקציות רבות של bbb האנושי. הימן/D3is אחד מקווי התא הנפוצים ביותר למידול bbb בתוך מבחנה4,5,6,7,8,9. למרות הערכים הנמוכים יחסית של ההתנגדות החשמלית של טראנסדותל, מידה של התכווצות מכשול, קו זה משמר את רוב המאפיינים המוורפולוגיים והפונקציונליים של תאי המוח האנדותל, אפילו כתרבות חד-תרבותית בהעדר תאים גליאל ממקור אורגני6,7. קו הבכצ/D3 cell מבטא מספר סמני bbb כולל מובילים וקולטנים פעילים עד למעבר 35 מבלי להיות בלתי מעורער לפנוטיפים לא יציבים6,7,9 ,10,11. המאפיין הבולט ביותר של קו מימן/D3 cell כמו מודל מבחנה bbb הוא היכולת ליצור tjs5,9,11,12. יש לציין כי למרות מודלים BBB הנגזר בתאי הראה חדירות גבוהות יותר במחקרים רבים בהשוואה לקו הבכצ/D3 cell הם מבטאים כמה סמנים BBB, הם עדיין להתפתח כמו הנפוץ ביותר BBB תא דגם13. חשוב להניח, תא גזע נגזר מודלים BBB להיות מאופיין ביחס מספר מעבר מקסימלי המאפשרים לתאים לשמור על יציבה BBB פנוטיפים14.
שלוש שיטות עיקריות משמשות בדרך כלל כדי לקבוע את שלמות המכשול TJ, כולל מדידה של מקדם הפרפיפיל, המדידה של המקדם חדירות לכאורה (Papp) של מולקולות של מעקב הידרופילי קטן כגון סוכרוז, אינולין, לוציפר צהוב, וכו ‘ וכתמים של סמנים מולקולריים ידועים של TJs כגון קלודין 5, ZO-1, סגר, וכו ‘.5. העגלון הוא שיטה פשוטה יחסית וכמותית המודד את ההתנגדות החשמלית ברחבי התא monolayers מתורבת על מצע ממברנה נקבובי5. עם זאת, ערכי העגלון יכולים להיות מושפעים ממשתנים ניסיוניים כגון קומפוזיציה של מדיום התרבות וסוג כלי המדידה. שילוב סביר של גורמים אלה מוביל להפצה רחבה של ערכי העגלון החל מ 2 כדי 1150 Ω ס”מ2 ב הבכצ/D3 קו התאים מתורבת עבור 2-21 ימים13. חיסוני היא שיטה חזותית לקבוע נוכחות של חלבונים TJ על ידי תיוג חלבון ממוקד באמצעות נוגדנים. עם זאת, חיסוני כרוך סדרה של שלבים ניסיוניים, כולל הצורך לתקן/חדירות תאים שעלולים לגרום לפריטים ניסיוניים ואותות פלורסנט עלול לדהות לאורך זמן. הגורמים הנ ל עלול להוביל לשגיאות סובייקטיבית המשפיעים על איכות הנתונים.
המוקד העיקרי של העבודה הזאת הוא להציג באופן ברור מאוד מבוסס חדירות לכאורה לקבוע את הקינטיקה של היווצרות מונאולייר שוטפת בתאי מימן/D3 מתורבתים. למרות שאחרים מתקדמים מערכות מחוץ לתחום, כגון מערכות שיתוף התרבות, מערכות microfluidic, הם מחקה מבחינה פיזיולוגית יותר הרלוונטיות עם פונקציית המכשול משופרת באופן משמעותי15,16,17, הבכצ/D3 transwell להגדיר היא מודל פשוט ואמין כדי להעריך את הקינטיקה של היווצרות TJ במהירות ההשפעה של ניסוחים תרופות שונות על תפקוד המכשול. באופן כללי, ערכי Papp עקביים לפתרונות הידרופיליים שונים בבכצ/D3 monolayers. לדוגמה, ערכי ה -P שדווחו עבור מספר פתרונות המסה המולקולריים הנמוכים (כגון סוכרוז, מאננירול, לולי, וכו ‘) בדגמים שונים של מודלים מחוץ לגופית הם בסדר של 10-4 ס”מ/min5,18,19 , 20. בכיוונון הנסיוני שלנו, תאי המוח האנדותל הם הזרע על קרום מיקרונקבובי קולגן מצופה עבור תא מצורף היווצרות מונאולייר לחקות את המכשול vivo. The LY הוסיף בצד פסגה צפוי לחצות את הצמתים הצמודים הבינסלולאריים ולהצטבר בצד basolateral. ריכוזים גדולים יותר של LY בצד הbasolateral לציין מכשול בלתי בוגר, לא במלואו פונקציונלי בעוד ריכוזים נמוכים לשקף הובלה מוגבלת בשל נוכחותם של TJs פונקציונלי וכתוצאה מכך מכשול בוגר.
LY הינו צבע הידרופילי עם פסגות עירור/פליטה ברורים וימנע את הצורך למולקולות מעקב רדיויניום כגון סוכרוז, ניטול או אינולין. כך, ערכי הקרינה הפלואורסצנטית של LY יכול לשמש ישירות לחשב באופן ישיר חדירות הקרנף שלה לאורך BBB monolayers. בנוסף, לעומת צבעים זמינים מסחרית רבים המשמשים בתחומים ביו הסובלים משמרות סטוקס קטן כגון fluorescein21, משמרת סטוקס של LY הוא על 108 ננומטר עם הפרדה ספקטרלית מספקת, ובכך מאפשר לנתונים בעלי קרינה פלואורסצנטית כ בדיקה חזקה כדי לקבוע חדירות הקרנף. השתמשנו בכתמים המערביים כטכניקה אורתוגונלית כדי להדגים שינויים בביטוי של חלבון סמן הצומת צר, ZO-1, על זמן התרבות. ZO-1 ביטוי שאותרו באמצעות בלוק המערבי משמש כדי להשלים את הנתונים האפליקציה ly p ובשילוב, נתונים אלה מראים כי השינויים נצפתה בערכים ly papp הוא רפלקטיבית היווצרות של מונאולייר עם עלייה הדרגתית ביטוי של סמן צומת צר, ZO-1.
כפי שציין קודם לכן, המוקד המרכזי של העבודה הזאת הוא להפגין שיטת LY כטכניקה פשוטה כדי לפקח על היווצרות של מונאולייר שוטפת עם צמתים הדוקים ופונקציונליים. עם זאת, כדי להדגים כלי נוסף של הסדר המפותח, אנו מדדו את ה-LY Papp ב-DNA ננו-חלקיק-transmec/D3 monolayers. חומצות גרעין ניתן לדחוס חלקיקי פוליאלקטרוליט עם קוטר של 100-200 ננומטר באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית בין קבוצות טעונה חיובי של פולימרים וקבוצות פוספט טעונה שלילית של חומצות גרעין22, 23. אנו מתייחסים אלה מתחמי כמו חלקיקי DNA (ה-dna NPs) בעבודתנו. בעוד הכוונה שלנו היא להתאים את התאים ולבטא את החלבון הרצוי, עלינו לוודא שמאפייני המכשול של הבכצ/D3 monolayers אינם נחשפים. הנתונים שלנו מצביעים על תקן 4 h ללוציפראז גן משטר אינו משנה באופן מגוון את חדירות ly להפגין את השירות של LY Papp האפליקציה כדי לקבוע שינויים שלמות המכשול TJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
תפקיד מרכזי של BBB הוא למנוע חילופי יונים לא חיוניים וחומרים רעילים בין המחזור הסיסטמי והמוח כדי לשמור על הומוסטאזיס של מיקרואקולוגיה עצבית. אחת התכונות האופייניות של ה-BBB היא היכולת של תאי האנדותל הקפיציאל ליצור צמתים הדוקים (TJs) החותמות ביעילות את תוואי התחבורה של הקרנף. הדגמנו באופן LYap…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים הם אסירי תודה על התמיכה הפיננסית של 2017 החוקר החדש של האגודה האמריקנית של בית המרקחת, הונקלאי מחלה חשש פרס מאוניברסיטת דוקיין ובית הספר של בית המרקחת כספים הפעלה עבור מעבדת Man,. אנחנו רוצים להודות המעבדה דליפה (האוניברסיטה דוקיין) עבור סיוע מערבי לחסום ומאפשר להשתמש האודיסיאה שלהם 16-bit imager. כמו כן, היינו רוצים לכלול מכתב הערכה מיוחד לקנארפ דייב (מעבדת מאנאיקרוס) לעזרה עם הכתמים המערביים.
Materials
| hCMEC/D3 cell line | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | human cerebral microvascular endothelial cell line |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | Plasmid DNA encoding luciferase gene |
| lucifer yellow CH dilithium salt | Invitrogen | 155267 | |
| Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes | Falcon | 353095 | |
| Tissue culture flask | Olympus Plastics | 25-207 | |
| 24-well Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-107 | |
| Black 96-Well Immuno Plates | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-minimum essential medium (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) |
| phosphate-buffered saline 1X | HyClone | SH3025601 | |
| Collagen Type I | Discovery Labware, Inc. | 354236 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Cell Culture Lysis 5X Reagent | Promega | E1531 | |
| Beetle Luciferin, Potassium Salt | Promega | E1601 | |
| SpectraMax i3 | Molecular Devices | Fluorescence Plate Reader | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher | 61-7300 | |
| anti-GAPDH antibody | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12-well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-106 | |
| RIPA buffer (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey CLx imager | LI-COR Biosciences | for scanning western blot membranes |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Camos, S., Mallolas, J. Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke. Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
- Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
- Tornabene, E., Brodin, B. Stroke and Drug Delivery–In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Llombart, V., et al. Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC). Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Avdeef, A. How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability?. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).
- Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
- Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
- Shao, X., et al. Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening. Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).
- Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).
- Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).
- Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development. Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650 (2007).
- Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. . The Blood-Brain Barrier. , 307-324 (2003).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
- Ren, T. B., et al. A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures. Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
- Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. Journal of Controlled Release. 65, (2000).
- Couraud, P. O. . The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. , (2012).
- Youdim, K. u. r. e. s. h. A., A, A. A. a. N. J. In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions. research focus reviews. 8, (2003).
- Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Balda, M. S., Anderson, J. M. Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms. The American Physiological Society. , (1992).
- Brown, R. C., Davis, T. P. Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke. Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).
- Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).
- Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis. Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).
- Tobey, N. A. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).
- Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).
- Posimo, J. M., et al. Viability assays for cells in culture. Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).
- Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke. Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).
- Kreuter, J. Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain. Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).
- Markoutsa, E., et al. Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).
